1. ప్రారంభ అవగాహన

ఈ దశలో, మన సీనియర్‌ల ముందు తప్పులు చేయకుండా ఉండాలంటే మనం కొన్ని భావనలు మరియు పరిభాషలను అర్థం చేసుకోవాలి, అవి:

ప్ర: RT-PCR, qPCR, రియల్ టైమ్ PCR మరియు రియల్ టైమ్ RT-PCR మధ్య తేడా ఏమిటి?

సమాధానం: RT-PCR అనేది రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ PCR(రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ PCR, RT-PCR), ఇది పాలీమరేస్ చైన్ రియాక్షన్ (PCR) యొక్క విస్తృతంగా ఉపయోగించే వేరియంట్.RT-PCRలో, ఒక RNA స్ట్రాండ్ కాంప్లిమెంటరీ DNAలోకి రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్ చేయబడింది, ఇది PCR ద్వారా DNA విస్తరణకు టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించబడుతుంది.
రియల్ టైమ్-PCR మరియు qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) ఒకే విషయం, రెండూ నిజ-సమయ పరిమాణాత్మక PCR, అంటే PCR యొక్క ప్రతి చక్రం నిజ-సమయ డేటా రికార్డులను కలిగి ఉంటుంది, కాబట్టి ప్రారంభ టెంప్లేట్‌ల సంఖ్యను ఖచ్చితమైన విశ్లేషణ సర్దుబాటు చేయవచ్చు.

రియల్-టైమ్ PCR (రియల్-టైమ్ ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR) మరియు రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ PCR (రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ PCR) రెండూ RT-PCRగా సంక్షిప్తీకరించబడినట్లు కనిపిస్తున్నప్పటికీ, అంతర్జాతీయ సమావేశం: RT-PCR ప్రత్యేకంగా రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌ను సూచిస్తుంది.PCR , రియల్ టైమ్ PCR సాధారణంగా qPCR (పరిమాణాత్మక నిజ-సమయ PCR)గా సంక్షిప్తీకరించబడుతుంది..

మరియు రియల్ టైమ్ RT-PCR (RT-qPCR), ఇది ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ టెక్నాలజీతో కలిపి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ PCR.: ముందుగా RNA రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ నుండి cDNA (RT)ని పొందండి, ఆపై పరిమాణాత్మక విశ్లేషణ (qPCR) కోసం రియల్-టైమ్ PCRని ఉపయోగించండి.చాలా ప్రయోగశాలలు RT-qPCR చేస్తాయి, అంటే RNA వ్యక్తీకరణ డౌన్-రెగ్యులేషన్‌పై పరిశోధన చేస్తాయి, కాబట్టి ప్రయోగశాలలో అందరూ మాట్లాడే qPCR వాస్తవానికి RT-qPCRని సూచిస్తుంది, అయితే క్లినికల్ అప్లికేషన్‌లలో ఇంకా చాలా DNA పరీక్షలు ఉన్నాయని మర్చిపోవద్దు.హెపటైటిస్ B వైరస్ HBV గుర్తింపు వంటి పరిమాణాత్మక విశ్లేషణ.

ప్రశ్న: చాలా ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR చదివిన తర్వాత, యాంప్లిఫైడ్ ఫ్రాగ్‌మెంట్ 80-300bp పరిధిలో ఎందుకు నియంత్రించబడాలి?

సమాధానం: ప్రతి జన్యు శ్రేణి యొక్క పొడవు భిన్నంగా ఉంటుంది, కొన్ని అనేక kb, కొన్ని వందల bp, కానీ ప్రైమర్‌లను డిజైన్ చేసేటప్పుడు ఉత్పత్తి పొడవు 80-300bp ఉండాలి, చాలా చిన్నది లేదా చాలా పొడవుగా ఉండటం ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR గుర్తింపుకు తగినది కాదు .ప్రైమర్-డైమర్ నుండి వేరు చేయడానికి ఉత్పత్తి భాగం చాలా చిన్నది.ప్రైమర్-డైమర్ యొక్క పొడవు సుమారు 30-40bp, మరియు అది 80bp కంటే తక్కువ ఉంటే అది ప్రైమర్-డైమర్ లేదా ఉత్పత్తి అని గుర్తించడం కష్టం.ఉత్పత్తి భాగం చాలా పొడవుగా ఉంటే, 300bp కంటే ఎక్కువగా ఉంటే, అది సులభంగా తక్కువ యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యానికి దారి తీస్తుంది మరియు జన్యువు మొత్తాన్ని సమర్థవంతంగా గుర్తించదు.

ఉదాహరణకు, మీరు తరగతి గదిలో ఎంత మంది ఉన్నారో లెక్కించినప్పుడు, మీరు ఎంత మంది నోరు ఉన్నారో మాత్రమే లెక్కించాలి.మీరు జన్యువులను గుర్తించినప్పుడు అదే నిజం, మొత్తం క్రమాన్ని సూచించడానికి మీరు జన్యువు యొక్క నిర్దిష్ట క్రమాన్ని మాత్రమే గుర్తించాలి.మీరు వ్యక్తులను లెక్కించాలనుకుంటే, మీరు నోరు మరియు ముక్కులు, చెవులు మరియు గాజులు రెండింటినీ లెక్కించాలి మరియు తప్పులు చేయడం సులభం.

విస్తరించేందుకు, బయోలాజికల్ రీసెర్చ్‌లో, పాయింట్ నుండి ప్రాంతానికి అనేక పరిశోధన కేసులు ఉన్నాయి, ఎందుకంటే ఏదైనా జాతుల జన్యు శ్రేణి చాలా పొడవుగా ఉంటుంది, బ్యాక్టీరియా 16S సీక్వెన్సింగ్ వంటి అన్ని శకలాలను కొలవడం అనవసరం మరియు అసాధ్యం, ఇది బ్యాక్టీరియా యొక్క నిర్దిష్ట జనాభా సంఖ్యను అంచనా వేయడానికి బ్యాక్టీరియా యొక్క సాంప్రదాయిక క్రమాన్ని నిర్వహించడం.

Q: qPCR ప్రైమర్ డిజైన్‌కు సరైన పొడవు ఎంత?

సమాధానం: సాధారణంగా చెప్పాలంటే, ప్రైమర్ పొడవు 20-24bp ఉంటుంది, ఇది మంచిది.వాస్తవానికి, ప్రైమర్ రూపకల్పన చేసేటప్పుడు మనం ప్రైమర్ యొక్క TM విలువకు శ్రద్ధ వహించాలి, ఎందుకంటే ఇది సరైన ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతకు సంబంధించినది.చాలా ప్రయోగాల తర్వాత, 60°C మంచి TM విలువ అని నిరూపించబడింది.ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత చాలా తక్కువగా ఉంటే, అది సులభంగా నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్‌కు దారి తీస్తుంది.ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత చాలా ఎక్కువగా ఉంటే, యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం సాపేక్షంగా తక్కువగా ఉంటుంది, యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్ యొక్క శిఖరం తర్వాత ప్రారంభమవుతుంది మరియు CT విలువ ఆలస్యం అవుతుంది.

ప్ర: ప్రోబ్ పద్ధతికి డై పద్ధతి ఎలా భిన్నంగా ఉంటుంది?

సమాధానం: రంగు పద్ధతిSYBR గ్రీన్ Ⅰ, PicoGreen, BEBO మొదలైన కొన్ని ఫ్లోరోసెంట్ రంగులు వాటంతట అవే కాంతిని విడుదల చేయవు, కానీ డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA యొక్క చిన్న గాడితో బంధించిన తర్వాత ఫ్లోరోసెన్స్‌ను విడుదల చేస్తాయి.అందువల్ల, PCR ప్రతిచర్య ప్రారంభంలో, యంత్రం ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్‌ను గుర్తించదు.ప్రతిచర్య ఎనియలింగ్-ఎక్స్‌టెన్షన్ దశకు చేరుకున్నప్పుడు, డబుల్ స్ట్రాండ్ తెరవబడుతుంది మరియు DNA పాలిమరేస్ చర్యలో కొత్త స్ట్రాండ్ సంశ్లేషణ చేయబడుతుంది మరియు ఫ్లోరోసెంట్ అణువు dsDNA మైనర్ గాడితో బంధిస్తుంది.PCR చక్రాల సంఖ్య పెరిగేకొద్దీ, మరింత ఎక్కువ రంగులు డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNAతో కలుపుతారు మరియు ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్ కూడా నిరంతరంగా మెరుగుపరచబడుతుంది.డై పద్ధతి ప్రధానంగా శాస్త్రీయ పరిశోధనలో ఉపయోగించబడుతుంది.
PS: ప్రయోగం చేసేటప్పుడు జాగ్రత్తగా ఉండండి, రంగును మానవ DNAతో కలపాలి, దానిని ఫ్లోరోసెంట్ వ్యక్తిగా మార్చడానికి జాగ్రత్తగా ఉండండి.

రంగు పద్ధతి (ఎడమ) ప్రోబ్ పద్ధతి (కుడి)
PS: ప్రయోగం చేసేటప్పుడు జాగ్రత్తగా ఉండండి, రంగును మానవ DNAతో కలపాలి, దానిని ఫ్లోరోసెంట్ వ్యక్తిగా మార్చడానికి జాగ్రత్తగా ఉండండి.

SYBR గ్రీన్ Ⅰ DNA యొక్క చిన్న గాడితో బంధిస్తుంది

ప్రోబ్ పద్ధతితక్మాన్ ప్రోబ్ అనేది సాధారణంగా ఉపయోగించే జలవిశ్లేషణ ప్రోబ్.ప్రోబ్ యొక్క 5′ చివరలో ఫ్లోరోసెంట్ సమూహం ఉంటుంది, సాధారణంగా FAM, మరియు ప్రోబ్ కూడా లక్ష్య జన్యువుకు అనుబంధంగా ఉంటుంది.3′ చివరలో ఫ్లోరోసెంట్ క్వెన్చింగ్ గ్రూప్ ఉంది.ఫ్లోరోసెన్స్ రెసొనెన్స్ ఎనర్జీ ట్రాన్స్‌ఫర్ (Förster రెసొనెన్స్ ఎనర్జీ ట్రాన్స్‌ఫర్, FRET) సూత్రం ప్రకారం, రిపోర్టర్ ఫ్లోరోసెంట్ గ్రూప్ (డోనర్ ఫ్లోరోసెంట్ మాలిక్యూల్) మరియు క్వెన్చింగ్ ఫ్లోరోసెంట్ గ్రూప్ (అక్సెప్టర్ ఫ్లోరోసెంట్ మాలిక్యూల్) ఉత్సాహంగా ఉన్నప్పుడు, స్పెక్ట్రా అతివ్యాప్తి చెంది, 7 దూరం పెరుగుతుంది. అంగీకార అణువు యొక్క ఫ్లోరోసెన్స్, అయితే ఆటోఫ్లోరోసెన్స్ బలహీనపడుతుంది.అందువల్ల, PCR ప్రతిచర్య ప్రారంభంలో, ప్రోబ్ వ్యవస్థలో ఉచితంగా మరియు చెక్కుచెదరకుండా ఉన్నప్పుడు, రిపోర్టర్ ఫ్లోరోసెంట్ సమూహం ఫ్లోరోసెన్స్‌ను విడుదల చేయదు.ఎనియలింగ్ చేసినప్పుడు, ప్రైమర్ మరియు ప్రోబ్ టెంప్లేట్‌కు కట్టుబడి ఉంటాయి.పొడిగింపు దశలో, పాలిమరేస్ నిరంతరం కొత్త గొలుసులను సంశ్లేషణ చేస్తుంది.DNA పాలిమరేస్ 5′-3′ ఎక్సోన్యూకలీస్ కార్యాచరణను కలిగి ఉంది.ప్రోబ్‌కు చేరుకున్నప్పుడు, DNA పాలిమరేస్ టెంప్లేట్ నుండి ప్రోబ్‌ను హైడ్రోలైజ్ చేస్తుంది, రిపోర్టర్ ఫ్లోరోసెంట్ సమూహాన్ని క్వెన్చర్ ఫ్లోరోసెంట్ గ్రూప్ నుండి వేరు చేస్తుంది మరియు ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్‌ను విడుదల చేస్తుంది.ప్రోబ్ మరియు టెంప్లేట్ మధ్య ఒకదానికొకటి సంబంధం ఉన్నందున, పరీక్ష యొక్క ఖచ్చితత్వం మరియు సున్నితత్వం పరంగా డై పద్ధతి కంటే ప్రోబ్ పద్ధతి గొప్పది.ప్రోబ్ పద్ధతి ప్రధానంగా రోగ నిర్ధారణలో ఉపయోగించబడుతుంది.

ప్ర: సంపూర్ణ పరిమాణీకరణ అంటే ఏమిటి?రిలేటివ్ క్వాంటిఫికేషన్ అంటే ఏమిటి?

సమాధానం: సంపూర్ణ పరిమాణీకరణ అనేది 1ml రక్తంలో ఎన్ని HBV వైరస్‌లు ఉన్నాయి వంటి qPCR ద్వారా పరీక్షించబడే నమూనా యొక్క ప్రారంభ కాపీ సంఖ్య యొక్క గణనను సూచిస్తుంది.సాపేక్ష పరిమాణీకరణ ద్వారా పొందిన ఫలితం మరొక సూచన నమూనాకు సంబంధించి నిర్దిష్ట నమూనాలో లక్ష్య జన్యువు మొత్తంలో మార్పు, మరియు జన్యు వ్యక్తీకరణ అప్-రెగ్యులేట్ లేదా డౌన్-రెగ్యులేట్ చేయబడింది.

ప్ర: RNA వెలికితీత మొత్తం, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సామర్థ్యం మరియు యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం ప్రయోగాత్మక ఫలితాలను ప్రభావితం చేస్తాయా?
ప్ర: నమూనా నిల్వ, ఎక్స్‌ట్రాక్షన్ రియాజెంట్‌లు, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ రియాజెంట్‌లు మరియు లైట్ ట్రాన్స్‌మిటింగ్ వినియోగ వస్తువులు ప్రయోగాత్మక ఫలితాలను ప్రభావితం చేస్తాయా?
ప్ర: ప్రయోగాత్మక డేటాను ఏ పద్ధతి సరిదిద్దగలదు?

ఈ సమస్యలకు సంబంధించి, మేము వాటిని దిగువ అధునాతన మరియు అధునాతన విభాగాలలో వివరంగా వివరిస్తాము.
2. అధునాతన జ్ఞానం

నిజ-సమయ ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCRకి సంబంధించి, ప్రతి సంవత్సరం వేలాది శాస్త్రీయ పరిశోధనా పత్రాలు ప్రచురించబడుతున్నాయనే వాస్తవాన్ని మనం గుర్తించాలి, వీటిలో ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR సాంకేతికత తక్కువ సంఖ్య కాదు.

ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR ప్రయోగాన్ని కొలవడానికి సాధారణ ప్రమాణం లేకుంటే, ఫలితాలు విస్తృతంగా మారవచ్చు.ఒకే జాతికి చెందిన ఒకే జన్యువు కోసం, అదే ప్రాసెసింగ్ పద్ధతితో, గుర్తించే ఫలితాలు కూడా విస్తృతంగా మారుతాయి మరియు ఆలస్యంగా వచ్చిన వారికి అదే ఫలితాలను పునరావృతం చేయడం కష్టం.ఏది ఒప్పో ఏది తప్పుదో ఎవరికీ తెలియదు.

ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR ఒక మోసగాడు సాంకేతికత లేదా నమ్మదగని సాంకేతికత అని దీని అర్థం?లేదు, ఎందుకంటే ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR మరింత సున్నితమైనది మరియు మరింత ఖచ్చితమైనది, మరియు కొద్దిగా తప్పు ఆపరేషన్ పూర్తిగా వ్యతిరేక ఫలితాలను ఇస్తుంది.ఒక చిన్న నష్టం వెయ్యి మైళ్ల దూరంలో ఉంది.వ్యాస రచయిత సమీక్షకులచే పదే పదే హింసించబడవచ్చు.అదే సమయంలో, జర్నల్ యొక్క సమీక్షకులు విభిన్న ప్రయోగాత్మక ఫలితాల నుండి ఎంచుకోవడం కూడా కష్టం.

మొత్తం మీద, నిజ-సమయ PCR ప్రయోగాలలో ఏకాభిప్రాయం లేకపోవడాన్ని సూచిస్తుంది.ఈ క్రమంలో, పరిశ్రమలోని సీనియర్ శాస్త్రవేత్తలు ప్రమాణాలను రూపొందించడం ప్రారంభించారు,ఈ ప్రమాణాలకు అనుగుణంగా వ్యాసంలో కొన్ని అవసరమైన ప్రయోగాత్మక మరియు డేటా ప్రాసెసింగ్ వివరాలను (అవసరమైన డేటాతో సహా) అందించాల్సిన అవసరం ఉంది.

సమీక్షకులు ఈ వివరాలను చదవడం ద్వారా ప్రయోగం యొక్క నాణ్యతను నిర్ధారించగలరు;భవిష్యత్ పాఠకులు ప్రయోగాన్ని పునరావృతం చేయడానికి లేదా ప్రయోగాన్ని మెరుగుపరచడానికి కూడా దీనిని ఉపయోగించవచ్చు.అప్పుడు ఈ విధంగా పొందిన ప్రయోగాత్మక ఫలితాలు పూర్తి సమాచారం, అధిక నాణ్యత మరియు ఉపయోగించదగినవి.

MIBBI (బయోలాజికల్ మరియు బయోమెడికల్ ఇన్వెస్టిగేషన్స్ కోసం కనీస సమాచారం -http://www.mibbi.org) ఉనికిలోకి వచ్చింది.MIBBI అనేది ప్రయోగాలకు ప్రమాణాలను అందించే ప్రాజెక్ట్.ఇది ప్రకృతిలో ప్రచురించబడింది.ఈ ప్రాజెక్ట్ మేము ఇప్పుడు చర్చించబోతున్న సెల్ బయాలజీ, మైక్రోఅరే, qPCR మొదలైన వివిధ జీవ ప్రయోగాలను లక్ష్యంగా చేసుకుంది మరియు మాన్యుస్క్రిప్ట్‌లను సమర్పించేటప్పుడు ప్రతి రకమైన ప్రయోగాన్ని అందిస్తుంది.ఆ సమాచారాన్ని ఎప్పటికప్పుడు అందించాలి.

MIBBI ప్రాజెక్ట్‌లో, ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCRకి సంబంధించిన రెండు కథనాలు ఉన్నాయి, అవి:
·RDML (రియల్-టైమ్ PCR డేటా మార్కప్ లాంగ్వేజ్) – రియల్ టైమ్ క్వాంటిటేటివ్ PCR డేటా కోసం నిర్మాణాత్మక భాష మరియు రిపోర్టింగ్ గైడ్;
·MIQE (క్వాంటిటేటివ్ రియల్-టైమ్ PCR ప్రయోగాల ప్రచురణ కోసం కనీస సమాచారం) - నిజ-సమయ పరిమాణాత్మక PCR ప్రయోగాల గురించి కథనాలను ప్రచురించడానికి కనీస సమాచారం.
ముందుగా, పరిభాష స్పెసిఫికేషన్ అయిన RDML గురించి మాట్లాడుకుందాం.

ప్రతిదానికీ ప్రామాణిక నిర్వచనం లేకపోతే, చర్చను కొనసాగించడం అసాధ్యం, అందుకే పరీక్షలో నిబంధనల వివరణ చాలా ముఖ్యమైనది.
ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR ప్రయోగంలో ఉపయోగించిన పదజాలం క్రింది కంటెంట్‌ను కలిగి ఉంటుంది.QIAGEN మాకు ఉత్తమ సారాంశాన్ని అందించింది.కిందివన్నీ పొడిగా ఉన్నాయివస్తువులు .

యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్
యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్ అనేది PCR ప్రక్రియలో తయారు చేయబడిన వక్రరేఖను సూచిస్తుంది, చక్రం సంఖ్యను అబ్సిస్సాగా మరియు రియాక్షన్ సమయంలో నిజ-సమయ ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రతను ఆర్డినేట్‌గా సూచిస్తుంది.

అద్భుతమైన యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్ కింది లక్షణాలను కలిగి ఉండాలి: బేస్లైన్ ఫ్లాట్ లేదా కొద్దిగా తగ్గింది, మరియు స్పష్టమైన పైకి ధోరణి లేదు;వక్రరేఖ యొక్క ఇన్‌ఫ్లెక్షన్ పాయింట్ స్పష్టంగా ఉంటుంది మరియు ఘాతాంక దశ యొక్క వాలు విస్తరణ సామర్థ్యానికి అనులోమానుపాతంలో ఉంటుంది.ఎక్కువ వాలు, అధిక విస్తరణ సామర్థ్యం;మొత్తం యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్ సమాంతరత మంచిది, ఇది ప్రతి ట్యూబ్ యొక్క యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం సమానంగా ఉంటుందని సూచిస్తుంది;తక్కువ-ఏకాగ్రత నమూనాల యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్ యొక్క ఘాతాంక దశ స్పష్టంగా ఉంటుంది.

బేస్‌లైన్ (బేస్‌లైన్)
ఆధారం అనేది ప్రారంభ చక్రం యొక్క శబ్దం స్థాయి, సాధారణంగా 3వ మరియు 15వ చక్రం మధ్య కొలుస్తారు, ఎందుకంటే యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తి వల్ల కలిగే ఫ్లోరోసెన్స్ విలువ పెరుగుదల ఈ కాలంలో గుర్తించబడదు.బేస్‌లైన్‌ను లెక్కించడానికి ఉపయోగించే సైకిల్‌ల సంఖ్య మారవచ్చు మరియు అధిక టెంప్లేట్ మొత్తాలను ఉపయోగించినట్లయితే లేదా లక్ష్య జన్యువు యొక్క వ్యక్తీకరణ స్థాయి ఎక్కువగా ఉంటే తగ్గించాల్సి ఉంటుంది.

బేస్‌లైన్‌ని సెట్ చేయడానికి లీనియారిటీ యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్ నుండి ఫ్లోరోసెన్స్ డేటాను చూడడం అవసరం.బేస్‌లైన్ సెట్ చేయబడింది, తద్వారా యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్ యొక్క పెరుగుదల బేస్‌లైన్ సైకిల్ టాప్ నంబర్ కంటే ఎక్కువ సైకిల్ నంబర్‌తో ప్రారంభమవుతుంది.ప్రతి లక్ష్య క్రమానికి బేస్‌లైన్‌లను వ్యక్తిగతంగా సెట్ చేయాలి.ప్రారంభ చక్రాలలో కనుగొనబడిన సగటు ఫ్లోరోసెన్స్ విలువలను విస్తరించిన ఉత్పత్తులలో పొందిన ఫ్లోరోసెన్స్ విలువల నుండి తీసివేయాలి.వివిధ రియల్-టైమ్ PCR సాఫ్ట్‌వేర్ యొక్క తాజా వెర్షన్‌లు వ్యక్తిగత నమూనాల కోసం బేస్‌లైన్ సెట్టింగ్‌ల ఆటోమేటిక్ ఆప్టిమైజేషన్‌ను అనుమతిస్తాయి.

PCR యాంప్లిఫికేషన్ రియాక్షన్ యొక్క మొదటి కొన్ని చక్రాల సమయంలో, ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్ పెద్దగా మారదు.సరళ రేఖను చేరుకోవడాన్ని బేస్‌లైన్ అంటారు, కానీ మనం మొదటి కొన్ని చక్రాలను నిశితంగా పరిశీలిస్తే, దిగువ చిత్రంలో ఏమి జరుగుతుందో బేస్‌లైన్‌లో ఉన్నట్లు మనం చూస్తాము.

నేపథ్య నేపథ్యం సూచిస్తుంది
ప్రతిచర్యలో నిర్దిష్ట-కాని ఫ్లోరోసెన్స్ విలువ.ఉదాహరణకు: అసమర్థమైన ఫ్లోరోసెన్స్ క్వెన్చింగ్;లేదా SYBR గ్రీన్ ఉపయోగించడం వల్ల పెద్ద సంఖ్యలో డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA టెంప్లేట్‌లు.సిగ్నల్ యొక్క నేపథ్య భాగాలు రియల్-టైమ్ PCR సాఫ్ట్‌వేర్ అల్గారిథమ్ ద్వారా గణితశాస్త్రపరంగా తీసివేయబడతాయి.

రిపోర్టర్ సిగ్నల్
రిపోర్టర్ సిగ్నల్ అనేది రియల్-టైమ్ PCR సమయంలో SYBR గ్రీన్ లేదా ఫ్లోరోసెంట్‌గా లేబుల్ చేయబడిన సీక్వెన్స్-స్పెసిఫిక్ ప్రోబ్స్ ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్‌ను సూచిస్తుంది.

సాధారణీకరించిన రిపోర్టర్ సిగ్నల్ (RN)
ప్రతి చక్రంలో కొలవబడిన నిష్క్రియ సూచన రంగు యొక్క ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రతతో విభజించబడిన రిపోర్టర్ డై యొక్క ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రతను RN సూచిస్తుంది.

నిష్క్రియ సూచన రంగు
కొన్ని నిజ-సమయ PCRలలో,ఫ్లోరోసెంట్ డై ROX ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్‌ను సాధారణీకరించడానికి అంతర్గత సూచనగా ఉపయోగించబడుతుంది.ఇది సరికాని పైప్‌టింగ్, వెల్ పొజిషన్ మరియు ఫ్లోరోసెన్స్ హెచ్చుతగ్గుల కారణంగా బాగా-బాగా ఆధారంగా వైవిధ్యాలను సరిచేస్తుంది.

ఫ్లోరోసెన్స్ థ్రెషోల్డ్ (థ్రెషోల్డ్)
నేపథ్య విలువ పైన మరియు యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్ యొక్క పీఠభూమి విలువ కంటే గణనీయంగా దిగువన సర్దుబాటు చేయబడింది.ఇది తప్పనిసరిగా యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్ యొక్క లీనియర్ ప్రాంతంలో ఉండాలి, ఇది PCR గుర్తింపు యొక్క లాగ్-లీనియర్ పరిధిని సూచిస్తుంది.లాగ్-యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్ వ్యూలో థ్రెషోల్డ్‌లు సెట్ చేయబడాలి, తద్వారా PCR యొక్క లాగ్-లీనియర్ దశ సులభంగా గుర్తించబడుతుంది.రియల్-టైమ్ PCRలో బహుళ లక్ష్య జన్యువులు ఉన్నట్లయితే, ప్రతి లక్ష్యానికి థ్రెషోల్డ్ తప్పనిసరిగా సెట్ చేయబడాలి.సాధారణంగా, PCR ప్రతిచర్య యొక్క మొదటి 15 చక్రాల యొక్క ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్ ఫ్లోరోసెన్స్ బ్యాక్‌గ్రౌండ్ సిగ్నల్‌గా ఉపయోగించబడుతుంది మరియు ఫ్లోరోసెన్స్ థ్రెషోల్డ్ PCR యొక్క మొదటి 3 నుండి 15 చక్రాల ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్ యొక్క ప్రామాణిక విచలనం కంటే 10 రెట్లు ఉంటుంది మరియు PCR ఆమ్ప్లెన్షియల్ ఫేజ్‌లో ఫ్లోరోసెన్స్ థ్రెషోల్డ్ సెట్ చేయబడింది.సాధారణంగా, ప్రతి పరికరం ఉపయోగం ముందు దాని ఫ్లోరోసెన్స్ థ్రెషోల్డ్ సెట్ చేయబడింది.

సైకిల్ థ్రెషోల్డ్ (CT) లేదా క్రాసింగ్ పాయింట్ (CP)
యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్ థ్రెషోల్డ్‌ను దాటే చక్రం (అంటే, ఫ్లోరోసెన్స్ డిటెక్షన్ గణనీయంగా పెరిగే పాయింట్).CT ఒక భిన్నం కావచ్చు మరియు ప్రారంభ టెంప్లేట్ మొత్తాన్ని లెక్కించవచ్చు.ప్రతి PCR రియాక్షన్ ట్యూబ్‌లోని ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్ సెట్ థ్రెషోల్డ్‌కు చేరుకున్నప్పుడు అనుభవించే చక్రాల సంఖ్యను CT విలువ సూచిస్తుంది.ప్రతి టెంప్లేట్ యొక్క CT విలువ మరియు టెంప్లేట్ యొక్క ప్రారంభ కాపీ సంఖ్య యొక్క లాగరిథమ్ మధ్య సరళ సంబంధం ఉంది,ప్రారంభ కాపీ సంఖ్య ఎక్కువ, CT విలువ చిన్నది మరియు వైస్ వెర్సా.తెలిసిన ప్రారంభ కాపీ సంఖ్యతో ప్రమాణాన్ని ఉపయోగించడం ద్వారా ప్రామాణిక వక్రరేఖను తయారు చేయవచ్చు, దీనిలో అబ్సిస్సా CT విలువను సూచిస్తుంది మరియు ఆర్డినేట్ ప్రారంభ కాపీ సంఖ్య యొక్క లాగరిథమ్‌ను సూచిస్తుంది.అందువల్ల, తెలియని నమూనా యొక్క CT విలువ పొందినంత కాలం, నమూనా యొక్క ప్రారంభ కాపీ సంఖ్యను ప్రామాణిక వక్రరేఖ నుండి లెక్కించవచ్చు.

ΔCT విలువ
ΔCT విలువ వివరిస్తుందిలక్ష్య జన్యువు మరియు సంబంధిత అంతర్జాత సూచన జన్యువు CT విలువ మధ్య వ్యత్యాసం, హౌస్ కీపింగ్ జన్యువు వంటిది మరియు ఉపయోగించిన టెంప్లేట్ మొత్తాన్ని సాధారణీకరించడానికి ఉపయోగించబడుతుంది:
⇒ΔCT = CT (టార్గెట్ జీన్) – CT (ఎండోజెనస్ రిఫరెన్స్ జీన్)

ΔΔCT విలువ
ΔΔCT విలువ ఆసక్తి యొక్క నమూనా యొక్క సగటు ΔΔCT విలువ (ఉదా, ఉత్తేజిత కణాలు) మరియు సూచన నమూనా యొక్క సగటు ΔΔCT విలువ (ఉదా, ఉద్దీపన లేని కణాలు) మధ్య వ్యత్యాసాన్ని వివరిస్తుంది.సూచన నమూనాను క్రమాంకనం నమూనా అని కూడా పిలుస్తారు మరియు సాపేక్ష పరిమాణీకరణ కోసం అన్ని ఇతర నమూనాలు దీనికి సాధారణీకరించబడతాయి:
⇒ΔΔCT = సగటు ΔCT (ఆసక్తి యొక్క నమూనా) - సగటు ΔCT (సూచన నమూనా)

ఎండోజెనస్ రిఫరెన్స్ జన్యువులు (ఎండోజెనస్ రిఫరెన్స్ జన్యువులు)
హౌస్ కీపింగ్ జన్యువులు (హౌస్ కీపింగ్ జన్యువులు) వంటి అంతర్జాత సూచన జన్యువుల వ్యక్తీకరణ స్థాయిలు నమూనాల మధ్య తేడా ఉండవు.సూచన జన్యువు యొక్క CT విలువలను లక్ష్య జన్యువుతో పోల్చడం వలన లక్ష్య జన్యువు యొక్క వ్యక్తీకరణ స్థాయిని ఇన్‌పుట్ RNA లేదా cDNA మొత్తానికి సాధారణీకరించడానికి అనుమతిస్తుంది (పైన ΔCT విలువలపై విభాగాన్ని చూడండి).

అంతర్గత సూచన జన్యువులు సరైనవిసాధ్యమయ్యే RNA క్షీణత లేదా RNA నమూనాలలో ఎంజైమ్ ఇన్హిబిటర్‌ల ఉనికి, అలాగే RNA కంటెంట్‌లో వైవిధ్యాలు, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సామర్థ్యం, ​​న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ రికవరీ మరియు నమూనా నిర్వహణ.సరైన సూచన జన్యువు(ల)ని ఎంచుకోవడానికి, మేము ప్రయోగాత్మక సెట్టింగ్‌పై ఆధారపడిన సరైన సూచన ఎంపికను అనుమతించడానికి అల్గారిథమ్‌ను సవరించాము.

అంతర్గత నియంత్రణ
లక్ష్య శ్రేణి వలె అదే ప్రతిచర్యలో విస్తరించబడిన నియంత్రణ శ్రేణి మరియు వేరొక ప్రోబ్‌తో (అనగా, డ్యూప్లెక్స్ PCR చేయడం) ప్రోబ్ చేయబడుతుంది.లక్ష్య క్రమాన్ని గుర్తించనప్పుడు వంటి విఫలమైన విస్తరణలను తోసిపుచ్చడానికి అంతర్గత నియంత్రణలు తరచుగా ఉపయోగించబడతాయి.
అమరిక నమూనా
ఒక సూచన నమూనా (ఉదాహరణకు, సెల్ లైన్ లేదా కణజాలం నుండి శుద్ధి చేయబడిన RNA) జన్యువు యొక్క సాపేక్ష వ్యక్తీకరణ స్థాయిని నిర్ణయించడానికి అన్ని ఇతర నమూనాలను పోల్చడానికి సంబంధిత పరిమాణంలో ఉపయోగించబడుతుంది.అమరిక నమూనా ఏదైనా నమూనా కావచ్చు, కానీ సాధారణంగా ఒక నియంత్రణ (ఉదాహరణకు, చికిత్స చేయని నమూనా లేదా ప్రయోగం యొక్క సున్నా నుండి నమూనా).

సానుకూల నియంత్రణలు
తో నియంత్రణ ప్రతిచర్యలను ఉపయోగించండిటెంప్లేట్ యొక్క తెలిసిన మొత్తాలు.ప్రైమర్ సెట్ లేదా ప్రైమర్-ప్రోబ్ సెట్ సరిగ్గా పని చేస్తుందో మరియు ప్రతిచర్య సరిగ్గా సెటప్ చేయబడిందో లేదో తనిఖీ చేయడానికి సానుకూల నియంత్రణలు తరచుగా ఉపయోగించబడతాయి.

టెంప్లేట్ నియంత్రణ లేదు (NTC)
టెంప్లేట్ మినహా యాంప్లిఫికేషన్ రియాక్షన్ యొక్క అవసరమైన అన్ని భాగాలను కలిగి ఉండే నియంత్రణ ప్రతిచర్య, ఇది సాధారణంగా నీటితో భర్తీ చేయబడుతుంది.NTC యొక్క ఉపయోగం రియాజెంట్ కాలుష్యం లేదా విదేశీ DNA వలన కలిగే కాలుష్యాన్ని కనుగొనవచ్చు, తద్వారా గుర్తింపు డేటా యొక్క ప్రామాణికత మరియు విశ్వసనీయతను నిర్ధారిస్తుంది.NTC నియంత్రణ యొక్క విస్తరణ కాలుష్యాన్ని సూచిస్తుంది.

RT నియంత్రణ లేదు (NRT)
RNA వెలికితీత ప్రక్రియలో అవశేష జన్యుసంబంధమైన DNA ఉండవచ్చు, ఇది చాలా హానికరం మరియు డేటా నాణ్యతను ప్రభావితం చేసే అపరాధి మరియు qPCR యొక్క సహజ శత్రువు, కాబట్టి ప్రయోగాలను రూపొందించేటప్పుడు, ఇది RNA గుర్తింపును విస్తరించేలా మాత్రమే రూపొందించబడాలి.రెండు మార్గాలు ఉన్నాయి, ఒకటి ఇంట్రాన్‌లలో ప్రైమర్‌లను రూపొందించడం, మరొకటి DNAని పూర్తిగా తొలగించడం, ఏది మంచిది, ఇది తరువాత చర్చించబడుతుంది.DNA కాలుష్యాన్ని గుర్తించడానికి ఎన్టీఆర్ నియంత్రణ ఒక అద్భుత దర్పణం.యాంప్లిఫికేషన్ ఉంటే, కాలుష్యం ఉందని అర్థం.

ప్రమాణాలు
ప్రమాణాలు అనేది ఒక ప్రామాణిక వక్రరేఖను నిర్మించడానికి ఉపయోగించే తెలిసిన ఏకాగ్రత లేదా కాపీ సంఖ్య యొక్క నమూనాలు.ప్రమాణం యొక్క స్థిరత్వాన్ని నిర్ధారించడానికి, జన్యు శకలం సాధారణంగా ప్లాస్మిడ్‌లోకి క్లోన్ చేయబడుతుంది మరియు ప్రమాణంగా ఉపయోగించబడుతుంది.

ప్రామాణిక వక్రత
సాధారణంగా రెట్టింపు నిష్పత్తి ప్రకారం ప్రామాణిక ఉత్పత్తితో కనీసం 5 ఏకాగ్రత ప్రవణతలుగా కరిగించబడుతుంది మరియు CT విలువ మరియు కాపీ సంఖ్య యొక్క కోఆర్డినేట్‌లలో 5 పాయింట్లు డ్రా చేయబడతాయి మరియు ప్రామాణిక వక్రతను రూపొందించడానికి పాయింట్‌లు లైన్‌ను రూపొందించడానికి అనుసంధానించబడతాయి.ప్రతి ప్రామాణిక వక్రత కోసం, దాని చెల్లుబాటును తనిఖీ చేయాలి.వాలు విలువ –3.3 మరియు –3.8 మధ్య పడిపోతుంది మరియు ప్రతి ఏకాగ్రత మూడుసార్లు నిర్వహించబడుతుంది.ఇతర పాయింట్ల నుండి గణనీయంగా భిన్నంగా ఉన్న పాయింట్లు విస్మరించబడాలి.పరీక్షించాల్సిన నమూనా యొక్క CT విలువ ప్రామాణిక వక్రరేఖలోకి తీసుకురాబడుతుంది మరియు పరీక్షించాల్సిన నమూనా యొక్క వ్యక్తీకరణ స్థాయిని లెక్కించవచ్చు.

పరీక్షించాల్సిన నమూనా యొక్క CT విలువ ప్రామాణిక వక్రరేఖలోకి తీసుకురాబడుతుంది మరియు పరీక్షించాల్సిన నమూనా యొక్క ప్రారంభ కాపీ సంఖ్యను లెక్కించవచ్చు.

సమర్థత మరియు వాలు
ప్రామాణిక వక్రరేఖ యొక్క వాలు నిజ-సమయ PCR యొక్క సామర్థ్యాన్ని సూచిస్తుంది.
·-3.322 యొక్క వాలు PCR యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం 1 లేదా 100% సమర్థవంతమైనదని సూచిస్తుంది మరియు ప్రతి చక్రంలో PCR ఉత్పత్తి మొత్తం రెట్టింపు అవుతుంది.
·–3.322 కంటే తక్కువ వాలు (ఉదా, –3.8) PCR సామర్థ్యాన్ని సూచిస్తుంది
·–3.322 కంటే ఎక్కువ వాలు (ఉదా, –3.0) PCR సామర్థ్యం 100% కంటే ఎక్కువగా ఉన్నట్లు సూచిస్తుంది, ఇది ఆసక్తిగా ఉంది, PCR యొక్క ఒక చక్రం విస్తరించిన ఉత్పత్తి కంటే రెట్టింపు కంటే ఎక్కువ ఎలా ఉత్పత్తి చేయగలదు?ఈ పరిస్థితి PCR ప్రతిచర్య యొక్క నాన్-లీనియర్ దశలో సంభవిస్తుంది, అంటే, పెద్ద మొత్తంలో నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ ఉంది.

ద్రవీభవన వక్రత
qPCR యాంప్లిఫికేషన్ పూర్తయిన తర్వాత, PCR ఉత్పత్తి వేడి చేయబడుతుంది.ఉష్ణోగ్రత పెరిగినప్పుడు, డబుల్ స్ట్రాండెడ్ యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తి క్రమంగా కరుగుతుంది, ఫలితంగా ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రత తగ్గుతుంది.ఒక నిర్దిష్ట ఉష్ణోగ్రత (Tm) చేరుకున్నప్పుడు, పెద్ద సంఖ్యలో ఉత్పత్తులు కరిగిపోతాయి.ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రంగా పడిపోతుంది.వేర్వేరు PCR ఉత్పత్తులు వేర్వేరు Tm విలువలు మరియు వేర్వేరు ద్రవీభవన ఉష్ణోగ్రతలను కలిగి ఉంటాయి, తద్వారా PCR యొక్క నిర్దిష్టతను గుర్తించవచ్చు.

మెల్టింగ్ కర్వ్ (ఉత్పన్న వక్రత)
పీక్ మ్యాప్‌ను రూపొందించడానికి ద్రవీభవన వక్రత ఉద్భవించింది, ఇది PCR ఉత్పత్తి శకలాలు యొక్క పరిస్థితిని మరింత స్పష్టంగా ప్రదర్శిస్తుంది.ద్రవీభవన ఉష్ణోగ్రత DNA ఫ్రాగ్మెంట్ యొక్క Tm విలువ అయినందున, DNA శకలం యొక్క Tm విలువను ప్రభావితం చేసే కొన్ని పారామితులను అంచనా వేయవచ్చు, అవి శకలం పరిమాణం, GC కంటెంట్ మొదలైనవి. సాధారణంగా చెప్పాలంటే, మా ప్రైమర్ డిజైన్ సూత్రాల ప్రకారం,విస్తరించిన ఉత్పత్తి యొక్క పొడవు 80-300bp పరిధిలో ఉంటుంది, కాబట్టి ద్రవీభవన ఉష్ణోగ్రత 80°C మరియు 90°C మధ్య ఉండాలి.

ద్రవీభవన వక్రరేఖ యొక్క వివరణ: 80°C-90°C మధ్య మాత్రమే ప్రధాన శిఖరం కనిపించినట్లయితే, ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR ఖచ్చితంగా ఉందని అర్థం;ప్రధాన శిఖరం 80°C-90°C మధ్య మరియు ఇతర శిఖరాలు 80°C కంటే తక్కువగా కనిపిస్తే, ప్రైమర్ డైమర్ ప్రాథమికంగా పరిగణించబడుతుంది.దాన్ని పరిష్కరించడానికి మీరు ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతని పెంచడానికి ప్రయత్నించవచ్చు;ప్రధాన శిఖరం 80°C-90°C మధ్య కనిపించినట్లయితే మరియు ఉష్ణోగ్రత పెరిగినప్పుడు ఇతర శిఖరం మళ్లీ కనిపించినట్లయితే, DNA కాలుష్యం ఉన్నట్లు ప్రాథమికంగా పరిగణించబడుతుంది మరియు ప్రయోగం యొక్క ప్రారంభ దశలో DNAని తీసివేయవలసి ఉంటుంది.

వాస్తవానికి, ఇంకా కొన్ని అసాధారణ పరిస్థితులు ఉన్నాయి, అవి ఒక్కొక్కటిగా క్రింద విభజింపబడతాయి.
3. అధునాతన జ్ఞానం

qPCR చేయడానికి, నేను MIQE అని చెప్పాలి,కనీస సమాచారంయొక్క ప్రచురణ కోసంపరిమాణాత్మకమైనదిరియల్ టైమ్ PCRప్రయోగాలు —నిజ సమయ పరిమాణాత్మక PCR గురించి కథనాలను ప్రచురించడానికి కనీస సమాచారంప్రయోగాలు.ప్రతి ఒక్కరి అవగాహనను సులభతరం చేయడానికి, మేము కీలకమైన కంటెంట్‌ను సరళీకృతం చేస్తాము.

మీరు ఇంటర్నెట్‌లో MIQE యొక్క అసలు వచనాన్ని శోధించవచ్చు మరియు అతి ముఖ్యమైన విషయం ఏమిటంటే అది నిర్దేశిస్తుందికథనాన్ని ప్రచురించేటప్పుడు అందించాల్సిన డేటా చెక్‌లిస్ట్ .

సమీక్షకులు ఈ వివరాలను చదవడం ద్వారా ప్రయోగం యొక్క నాణ్యతను నిర్ధారించగలరు;భవిష్యత్ పాఠకులు ప్రయోగాన్ని పునరావృతం చేయడానికి లేదా మెరుగుపరచడానికి కూడా దీన్ని ఉపయోగించవచ్చు.
ఈ జాబితాలో, ప్రతి జాబితా యొక్క ప్రాముఖ్యత వరుసగా E లేదా Dతో గుర్తించబడిందని గమనించాలి.దాని అర్థం ఏమిటి?ఇ: అవసరమైన సమాచారం (తప్పక సమర్పించాలి);D: కావాల్సిన సమాచారం (సాధ్యమైనంత వరకు అందించండి).

MIQE (1)-ప్రయోగాత్మక రూపకల్పన
గ్రాడ్యుయేట్ స్టడీస్ పూర్తి చేసిన తర్వాత డిఫెన్స్ పూర్తి చేసిన చాలా మంది స్కాంబాగ్‌లకు స్వతంత్రంగా ఒక ప్రయోగాన్ని ఎలా రూపొందించాలో, వారి నోట్‌బుక్‌లను తెరవాలో మరియు ఉపాధ్యాయుడు ఏమి చేయమని చెప్పాలో తెలియదు.దీంతో ప్రయోగాత్మక రూపకల్పన కఠినంగా లేదని, ఈ చిత్రాన్ని, ఆ చిత్రాన్ని రూపొందించాలని భావించామని, అందుకే మతిభ్రమించి చేశామని పత్రిక సంపాదకీయ విభాగం తెలిపింది.స్కాంబాగ్‌లు ఇలా తయారవుతాయి!

ఇంటికి దగ్గరగా, ప్రయోగం యొక్క మొదటి సూత్రం గుర్తించడంప్రయోగాత్మక తర్కం యొక్క దృఢత్వం.అత్యంత ప్రాథమికమైన విషయం ప్రయోగాత్మక రూపకల్పన, మరియు ప్రయోగాత్మక రూపకల్పనలో అత్యంత ముఖ్యమైన విషయం ఏమిటంటే, లక్ష్య నమూనా, సూచన నమూనా (నియంత్రణ) మరియు పునరావృతాల సంఖ్యను ఎలా సెట్ చేయాలి, తద్వారా ప్రయోగాత్మక డేటాను సూచించవచ్చు, పోల్చవచ్చు మరియు ఒప్పించవచ్చు.

లక్ష్య నమూనాఒక నిర్దిష్ట చికిత్స తర్వాత లక్ష్య జన్యువును గుర్తించడానికి అవసరమైన నమూనాను సూచిస్తుంది.సూచన నమూనాఎటువంటి చికిత్స లేకుండా నమూనా, ఇది తరచుగా జీవశాస్త్రంలో వైల్డ్ రకంగా సూచించబడుతుంది.

ప్రయోగాత్మక ప్రతిరూపాలుచాలా ముఖ్యమైనవి.సాధారణంగా, ఒప్పించే ప్రతిరూపాల సంఖ్య తప్పనిసరిగా మూడు కంటే ఎక్కువ ఉండాలి.బయోలాజికల్ రెప్లికేషన్ అంటే ఏమిటి మరియు టెక్నికల్ రెప్లికేషన్ అంటే ఏమిటో గుర్తించడం అవసరం.

జీవ ప్రతిరూపాలు: ఒకే ధృవీకరణ ప్రయోగం వివిధ పదార్థాలతో (సమయం, మొక్కలు, బ్యాచ్‌లు, రియాక్షన్ ప్లేట్లు)తో చేయబడుతుంది.

బయోలాజికల్ డూప్లికేషన్
మిరియాల పురుగుమందుల చికిత్సను ఉదాహరణగా తీసుకుందాం.మేము ABC యొక్క మూడు మొక్కలపై పురుగుమందులను పిచికారీ చేయాలనుకుంటున్నాము, అప్పుడు ABC యొక్క మూడు మొక్కలు మూడు జీవ ప్రతిరూపాలు మరియు అవి వేర్వేరు పదార్థాలతో చేసిన ఒకే ధృవీకరణ ప్రయోగం.కానీ ఒక ప్రయోగంగా, ఖచ్చితంగా నియంత్రణ అవసరం, కాబట్టి మేము మొక్క A యొక్క ప్రయోగాత్మక సమూహాన్ని ఏర్పరచడానికి మొక్క A యొక్క శాఖలలో ఒకదానిని పిచికారీ చేయవచ్చు మరియు నియంత్రణ సమూహాన్ని ఏర్పరచడానికి A మొక్క యొక్క ఇతర శాఖలను పిచికారీ చేయకూడదు.B మరియు C కోసం అదే చేయండి.

సాంకేతిక ప్రతిరూపాలు (సాంకేతిక ప్రతిరూపాలు): ఇది ఆపరేషన్ వల్ల ఏర్పడే లోపాలను నివారించడానికి రూపొందించబడిన పునరావృత ప్రయోగం, ఇది వాస్తవానికి అదే మెటీరియల్‌లో చేర్చబడిన డూప్లికేట్ రంధ్రం.చికిత్సలు మరియు నియంత్రణలు రెండూ తప్పనిసరిగా లక్ష్య జన్యువు మరియు అంతర్గత సూచన జన్యువు యొక్క ప్రతిరూప సెట్టింగ్‌లను (కనీస మూడు) కలిగి ఉండాలి.

సాంకేతిక పునరావృతం
పురుగుమందులు కలిపిన మిరియాలను మళ్లీ ఉదాహరణగా తీసుకోండి.ప్లాంట్ A యొక్క ప్రయోగాత్మక సమూహం కోసం, మేము దాని లక్ష్య జన్యువు మరియు అంతర్గత సూచన జన్యువు కోసం వరుసగా 1, 2 మరియు 3 యొక్క మూడు PCR రంధ్రాలను తయారు చేసాము, తద్వారా గుర్తించిన తర్వాత సగటును తీసుకుంటాము.మొక్కల నియంత్రణ కోసం ఎ గ్రూపులను కూడా అదే విధంగా వ్యవహరిస్తారు.అదేవిధంగా, B మరియు C మొక్కలకు అదే చికిత్స చేయండి.ఇది సాంకేతిక పునరావృతం.

ఇది గమనించదగ్గ విషయంగణాంకాలలోకి ప్రవేశించేది జీవసంబంధమైన పునరావృతం, మరియు సాంకేతిక పునరావృతం అనేది ప్రయోగాత్మక ప్రక్రియలో ఏవైనా యాదృచ్ఛిక దృగ్విషయాలు ఉన్నాయా అని పరీక్షించడం, తద్వారా ప్రయోగాత్మక ఫలితాలను విశ్వసనీయంగా చేయడం, అంటే మనం తరచుగా చెప్పే వాటి సగటును తీసుకోవడం ద్వారా లోపాలను నివారించడం.

ప్రతికూల నియంత్రణలు-NTC మరియు NRT
NTC (నో-టెంప్లేట్ నియంత్రణ), టెంప్లేట్ లేని నియంత్రణ, ప్రయోగాత్మక పదార్థం కలుషితమైందో లేదో ధృవీకరించడానికి ఉపయోగించబడుతుంది.సాధారణంగా, నీటిని ఒక టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగిస్తారు.ఫ్లోరోసెంట్ ప్రతిచర్య ఉంటే, ప్రయోగశాలలో న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ కాలుష్యం సంభవించిందని ఇది సూచిస్తుంది.

ఈ కాలుష్యాలు దీని నుండి వస్తాయి: అశుద్ధ నీరు, ఎండోజెనస్ DNA కలిగి ఉన్న అర్హత లేని కారకాలు, ప్రైమర్ కాలుష్యం, ప్రయోగశాల పరికరాల కాలుష్యం, ఏరోసోల్ కాలుష్యం మొదలైనవి, RNase స్కావెంజర్లు మరియు RNase ఇన్హిబిటర్‌లను ఉపయోగించాల్సిన అవసరం ఉంది.ఏరోసోల్ కాలుష్యం కనుగొనడం చాలా కష్టం.మీ ప్రయోగశాల గాలిలో వివిధ న్యూక్లియిక్ యాసిడ్‌లతో కూడిన పొగమంచులా ఉందని ఊహించుకోండి.

NRT (నో-రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్), రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ లేని నియంత్రణ, ప్రతికూల నియంత్రణగా నాన్-రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టెడ్ RNA, ఇది gDNA అవశేషాల నియంత్రణ.

జన్యు వ్యక్తీకరణ చేస్తున్నప్పుడు, రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ తర్వాత cDNA మొత్తాన్ని గుర్తించడం ద్వారా RNA మొత్తం కనుగొనబడుతుంది.RNA శుద్ధి చేయబడినప్పుడు gDNA అవశేషాలు ఉంటే, అది ప్రయోగాత్మక ఫలితాలలో లోపాలను కలిగిస్తుంది, ఎందుకంటే పొందిన వాస్తవ ఫలితాలు gDNA మరియు cDNA.మొత్తం స్థాయిలో, కేవలం cDNA మాత్రమే కాదు, RNA వెలికితీత సమయంలో gDNA పూర్తిగా తీసివేయబడాలి.

MIQE (2)-నమూనా సమాచారం
నమూనా సమాచారం అని పిలవబడేది అంటే, మేము qPCR గురించి కథనాన్ని ప్రచురించినప్పుడు, మేము తప్పనిసరిగా నమూనా సమాచారాన్ని స్పష్టంగా వివరించాలి, ఇది కథనంలో అనివార్యమైన భాగం.అదేవిధంగా, మేము నమూనాలను ప్రాసెస్ చేసినప్పుడు, నమూనాల చెల్లుబాటును నిర్ధారించడానికి మేము మా స్వంత కార్యకలాపాలను కూడా నియంత్రించాలి.

నమూనా యొక్క వివరణ ఫలితం మాత్రమే, మరియు మేము మొత్తం ప్రయోగం సమయంలో తీసుకున్న పదార్థాలపై మరింత శ్రద్ధ వహించాలి.

ప్రయోగాత్మక పదార్థాల ఎంపిక
రక్త నమూనాలు - తాజా రక్తాన్ని ఎంచుకోండి, 4 గంటల కంటే ఎక్కువ కాదు.కణ నమూనాలు - బలమైన పెరుగుదల కాలంలో తాజా కణాలను సేకరించేందుకు ఎంచుకోండి.జంతు కణజాలం-తాజాగా, బలంగా పెరుగుతున్న కణజాలాన్ని ఎంచుకోండి.మొక్కల కణజాలం - తాజా, యువ కణజాలాన్ని ఎంచుకోండి.

ఈ కొన్ని వాక్యాలలో ఒక కీలక పదం ఉందని మీరు గమనించి ఉండాలి: ఫ్రెష్ .
పై నమూనాల కోసం, మార్కెట్లో అత్యుత్తమమైన, ఖర్చుతో కూడుకున్న మరియు స్థిరమైన కిట్ ఫోర్జీన్ కిట్, ఇది త్వరగా మరియు సులభంగా వాటి DNA మరియు RNAలను సంగ్రహించగలదు.

రక్త DNA మినీ కిట్

సెల్ మొత్తం RNA ఐసోలేషన్ కిట్

యానిమల్ టోటల్ RNA ఐసోలేషన్ కిట్

మొక్క మొత్తం RNA ఐసోలేషన్ కిట్

ప్లాంట్ టోటల్ RNA ఐసోలేషన్ కిట్ ప్లస్

మొక్క DNA ఐసోలేషన్ కిట్

ప్రయోగాత్మక పదార్థాల నిల్వ
సాధారణంగా చెప్పాలంటే, పరిస్థితులు అనుమతిస్తే, నమూనాలను నిల్వ చేయమని మేము సిఫార్సు చేయము.అయినప్పటికీ, నమూనా తీసుకున్న వెంటనే ప్రయోగాలు చేయలేని స్నేహితులు చాలా మంది ఉన్నారు మరియు కొందరు నమూనా కోసం ద్రవ నైట్రోజన్ ట్యాంకులను కూడా ఫీల్డ్‌కు తీసుకెళ్లాలి.

ఈ రకమైన కష్టపడి పనిచేసే స్నేహితుని కోసం, మీరు రియాజెంట్ వినియోగ వస్తువులు అర్థం చేసుకోలేదని మాత్రమే చెప్పగలను.ఇప్పుడు చాలా రియాజెంట్ వినియోగించదగిన కంపెనీలు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద RNA నమూనాలను నిల్వ చేయగల రియాజెంట్‌లను ఉత్పత్తి చేస్తాయి మరియు మీరు వాటిని ఉపయోగించడానికి ఎంచుకోవచ్చు.సాంప్రదాయిక నిల్వ పద్ధతి ద్రవ నత్రజని నిల్వ, సులభంగా తీసుకువెళ్లే చిన్న ద్రవ నైట్రోజన్ ట్యాంక్‌ను ఉపయోగించడం.నమూనాను తిరిగి ప్రయోగశాలకు తీసుకువచ్చిన తర్వాత, దానిని -80 ° C రిఫ్రిజిరేటర్‌లో నిల్వ చేయండి.

RNAతో కూడిన ప్రయోగాల కోసం, ఆరు పదాల సూత్రాన్ని తప్పనిసరిగా అనుసరించాలి:తక్కువ ఉష్ణోగ్రత, ఎంజైములు లేవు,మరియువేగంగా .

తక్కువ ఉష్ణోగ్రత భావన అర్థం చేసుకోవడం సులభం;ఎంజైమ్‌లు లేకుండా, RNase అనేది మనం నివసించే ప్రపంచంలో ప్రతిచోటా ఉంటుంది (లేకపోతే మీరు HIV చేత చంపబడేవారు), కాబట్టి ప్రయోగాలు చేసేటప్పుడు RNaseని ఎలా నివారించాలి అనేది చాలా ముఖ్యమైన భావన;వేగంగా,ప్రపంచంలో కుంగ్ ఫూని విచ్ఛిన్నం చేయలేనిది లేదు, వేగాన్ని మాత్రమే విచ్ఛిన్నం చేయలేము.

అందువల్ల, ఒక కోణంలో, వెలికితీత సమయం తక్కువగా ఉంటుంది, కిట్ మంచిది.ఎందుకుఫోర్జీన్యొక్క కిట్ వేగాన్ని నొక్కి చెబుతుంది, ఎందుకంటే వారికి అది బాగా తెలుసు.

PS: కొంతమంది అమ్మాయిలు చాలా జాగ్రత్తగా ప్రయోగాలు చేస్తారు, కానీ వారు చాలా సంవత్సరాల పని తర్వాత స్లామ్ డంక్ వలె మంచివారు కాదు.దేవుడు అన్యాయమని, ఇతరులపై ఫిర్యాదు చేస్తూ, జీవితం కోసం చూస్తున్నాడని వారు భావిస్తారు.నిజానికి అది ఆమెకు అర్థం కాలేదు.అతను RNAను బాగా రక్షించలేదు మరియు స్లామ్ డంక్ ప్లేయర్ అతి చురుకైనవాడు.ప్రయోగం చేస్తున్నప్పుడు మూడుసార్లు, ఐదుసార్లు, రెండు విభాగాలతో స్లామ్‌ డంక్‌ను పూర్తి చేస్తానని అనుకున్నా.. ఆ ప్రయోగాన్ని బాగానే చేశాడు.

గమనిక: నెమ్మదిగా, RNase దాడికి ఎక్కువ అవకాశాలు.వేగంగా ఉండటానికి మిమ్మల్ని మీరు ఎలా శిక్షణ పొందాలి?మార్గం లేదు, ఎక్కువ సాధన చేయండి.

విభిన్న ప్రయోగాలు మరియు విభిన్న నమూనాల కోసం, మరింత సాహిత్యాన్ని చదవడం మరియు ప్రాసెసింగ్ కోసం తగిన పద్ధతిని ఎంచుకోవడం ఇంకా అవసరం.నమూనా సేకరణ మరియు నిల్వ ప్రక్రియ కోసం, MIQE తప్పనిసరిగా పేపర్‌లో స్పష్టంగా వ్రాయబడాలి, తద్వారా సమీక్షకులు కాగితం విశ్వసనీయతను సమీక్షించగలరు మరియు ఆశ్చర్యపోయిన యువకులు మీ ప్రయోగాన్ని పునరావృతం చేయడం కూడా సౌకర్యంగా ఉంటుంది.

జీవ ప్రయోగాలు కష్టమైనప్పటికీ, అవి ఉన్నతమైనవి.మీరు జాగ్రత్తగా ఉండకపోతే, మీరు ప్రపంచాన్ని తారుమారు చేయవచ్చు.ఉదాహరణకు, SARS ను జీవరసాయన సంక్షోభంగా మార్చడం లేదా 1.3 బిలియన్ల ప్రజలను రక్షించడానికి హైబ్రిడ్ బియ్యం తయారు చేయడం.క్రింద ఉన్న చిత్రం ఒక రసాయన ప్రయోగం, అతని డిక్ లాంటి రూపాన్ని చూడటం ద్వారా మీరు మీ పరిశోధన గురించి ఎంత గర్వపడుతున్నారో అర్థం చేసుకోవాలి.దాన్ని మరచిపోకండి, అతన్ని నల్లగా చేయవద్దు.

MIQE (3) - న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ వెలికితీత.
న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ వెలికితీత అనేది ఒక పెద్ద సంఘటన, మరియు అన్ని పరమాణు జీవశాస్త్ర ప్రయోగాలు న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ వెలికితీతతో ప్రారంభమవుతాయి.ముందుగా, న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ వెలికితీతపై MIQE యొక్క కంటెంట్‌ను కాపీ చేద్దాం.

ఈ రూపాన్ని చూస్తే, మీరు ఉపరితలంపై ఉండలేరు.రూపం ఒక సిద్ధాంతం.అగ్రశ్రేణి విద్యార్థి కావాలంటే, మీరు ఎందుకు అని అడగాలి.ఈ పట్టిక యొక్క ముఖ్యమైన కంటెంట్: కొనసాగించుRNA యొక్క స్వచ్ఛత, సమగ్రత, స్థిరత్వం మరియు వెలికితీత మొత్తం .

యొక్క మొదటి భాగంప్రక్రియ లేదా పరికరం న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ వెలికితీత దశ.మీరు సంగ్రహించడానికి ఆటోమేటిక్ న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ ఎక్స్‌ట్రాక్టర్‌ని ఉపయోగిస్తే (అధునాతనమైనది, దయచేసి కొనుగోలు కోసం నన్ను సంప్రదించండి), మీరు పరికరం యొక్క మోడల్ పేరును సూచించాలి.

కిట్ పేరు మరియు

మార్పు వివరాల కోసం ఏ కిట్ ఉపయోగించబడింది, ఏ ప్రత్యేక కారకాలు జోడించబడ్డాయి లేదా ఏ ప్రత్యేక ఆపరేషన్లు చేశారో స్పష్టంగా వివరించాలి, తద్వారా ఇతరులు మీ ప్రయోగాన్ని సులభంగా పునరావృతం చేయవచ్చు.

కొంతమంది ప్రత్యేక నమూనాలను వెలికితీసేటప్పుడు కొన్ని ప్రత్యేక కారకాలను జోడిస్తారు, ఇది తమ రహస్య ఆయుధంగా భావించి ఇతరులకు చెప్పకండి.గోప్యంగా ఉంచుతూనే, మీ వ్యాసాన్ని ప్రకాశింపజేసే అవకాశాన్ని కూడా కోల్పోతారు.తెలివితేటలు వద్దు, శాస్త్ర పరిశోధనలో దేశ ముసలి జాంగ్ కంటే నిజాయితీగా ఉండాలి, తెలివితేటలు కావాలంటే, కథనం మిమ్మల్ని మూర్ఖుడిని చేస్తుంది.

కిట్ యొక్క ఉత్పత్తి సంఖ్యను గుర్తుంచుకోవాలిమీరు కిట్‌ని ఆర్డర్ చేసి, కథనాన్ని వ్రాసినప్పుడు.కిట్‌లో సాధారణంగా రెండు సంఖ్యలు ఉంటాయి: పిల్లి—కేటలాగ్ నంబర్ (ఉత్పత్తి సంఖ్య, కథనం నంబర్), లాట్—ఉత్పత్తి లాట్ నంబర్ (ఉత్పత్తి ఏ బ్యాచ్ నుండి వచ్చిందో సూచించడానికి ఉపయోగించబడుతుంది).

అదనంగా, బయోకెమికల్ రియాజెంట్‌లను ఆర్డర్ చేసేటప్పుడు CAS నంబర్ తరచుగా ఉపయోగించబడుతుంది మరియు నేను దానిని కలిసి ప్రాచుర్యం పొందుతాను.CAS సంఖ్య అనేది ప్రతి కొత్త రసాయన ఔషధానికి అమెరికన్ కెమికల్ సొసైటీ ఇచ్చిన సంఖ్య.సాధారణంగా, మూడు సంఖ్యలు డాష్ ద్వారా అనుసంధానించబడి ఉంటాయి.రుషుయ్ యొక్క CAS నంబర్: 7732-18-5.రసాయనాలు తరచుగా బహుళ మారుపేర్లను కలిగి ఉంటాయి, కానీ CAS సంఖ్య ప్రత్యేకంగా ఉంటుంది.ఔషధాన్ని ఆర్డర్ చేసేటప్పుడు, మీరు ముందుగా దాని CAS నంబర్‌ని తనిఖీ చేయవచ్చు.

ఇంటికి దగ్గరగా, మనం ఈ విషయాలను ఎందుకు స్పష్టంగా వివరించాలి?వాస్తవానికి, ఇది RNA వెలికితీత నాణ్యతను తనిఖీ చేయడం కూడా.సాధనాలు మరియు కిట్‌ల ఉపయోగం RNA వెలికితీతను మరింత స్థిరంగా చేస్తుంది.సాధారణ ప్రయోగశాలల వెలికితీత స్థాయి పెద్దది కాదు మరియు దానిని కిట్‌లతో పొందవచ్చు.

DNase లేదా RNase చికిత్స యొక్క వివరాలు
ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR యొక్క ముఖ్యమైన సమస్య DNA కాలుష్యాన్ని నిరోధించడం మరియు కాలుష్యం ఉన్నట్లయితే ప్రయోగాలు చేయవద్దు.కాబట్టి, ప్రయోగాత్మక ప్రక్రియలో DNA పూర్తిగా మరియు పూర్తిగా తీసివేయబడిందని నిరూపించడానికి, DNAని ప్రాసెస్ చేయడానికి మీరు ఉపయోగించిన ప్రక్రియను పేర్కొనడం అత్యవసరం.స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం ద్వారా సూచించబడుతుంది.

RNA మరియు DNA యొక్క స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం
సాధారణంగా, DNAని తొలగించే పద్ధతి RNAను వెలికితీసిన తర్వాత DNaseతో చికిత్స చేయడం.అయితే, ఇవి సాపేక్షంగా పాత పద్ధతులు.వాణిజ్య RNA వెలికితీత కిట్‌లు DNaseని జోడించకుండానే వెలికితీత ప్రక్రియలో DNAని తీసివేయగలిగాయి.ఉదాహరణకు, ఫోర్జీన్ నుండి కిట్‌ల శ్రేణి .

గమనిక: RNA వెలికితీత సమయంలో DNA తొలగించడం అనేది చాలా ప్రమాదకరమైన ద్విపద కత్తి, ఇది RNA వెలికితీత యొక్క ఆపరేషన్ సమయాన్ని పొడిగిస్తుంది మరియు RNA క్షీణత ప్రమాదాన్ని పెంచుతుంది.ప్రాథమికంగా, ఇది RNA దిగుబడి మరియు స్వచ్ఛత మధ్య వర్తకం.

అదనంగా, సిలికా-ఆధారిత శోషణ నిలువు వరుసకు జోడించబడిన DNase మొత్తం చాలా తక్కువగా ఉంటుంది మరియు ప్రభావాన్ని సాధించడానికి అధిక-నాణ్యత DNaseని తప్పనిసరిగా ఉపయోగించాలి.ఆప్టిమైజ్ చేయని DNase త్వరగా మరియు పూర్తిగా జీర్ణం కాదు.ఇది వ్యాపారి సాంకేతిక స్థాయికి సంబంధించిన పరీక్ష.అయితే, DNase లేకుండా DNA తీసివేయబడుతుందని గొప్పగా చెప్పుకునే విచిత్రమైన వ్యాపారులు కూడా ఉన్నారు.డీఎన్‌ఏస్ లేకుండా డీఎన్‌ఏను పూర్తిగా తొలగించవచ్చని ప్రగల్భాలు పలికే వారెవరైనా పోకిరి అని చెప్పవచ్చు.DNA అనేది సాపేక్షంగా స్థిరంగా ఉండే డబుల్ స్ట్రాండెడ్ స్ట్రక్చర్, మరియు ఇది కేవలం మాట్లాడటం మరియు నవ్వడం ద్వారా తుడిచిపెట్టబడదు.

కాలుష్యం అంచనా
అంచనా పద్ధతి: ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ డిటెక్షన్, 1% అగరోజ్, 6V/సెం.మీ, 15నిమి, లోడింగ్ 1-3 ఉల్

న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ పరిమాణాత్మక విశ్లేషణ
సాధారణంగా UV స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ ఉపయోగించి కొలుస్తారు.నేను మొదట OD260, OD280 మరియు OD230 యొక్క మూడు విలువల అర్థాన్ని ప్రాచుర్యంలోకి తెస్తాను.
·OD260nm: ఇది న్యూక్లియిక్ ఆమ్లం యొక్క అత్యధిక శోషణ శిఖరం యొక్క శోషణ తరంగదైర్ఘ్యం మరియు ఉత్తమంగా కొలిచిన విలువ 0.1 నుండి 1.0 వరకు ఉంటుంది.కాకపోతే, దానిని పరిధిలోకి తీసుకురావడానికి నమూనాను పలుచన చేయండి లేదా కేంద్రీకరించండి.
·OD280nm: ఇది ప్రోటీన్ మరియు ఫినాలిక్ పదార్ధాల యొక్క అత్యధిక శోషణ శిఖరం యొక్క శోషణ తరంగదైర్ఘ్యం.
·OD230nm: ఇది కార్బోహైడ్రేట్ల యొక్క అత్యధిక శోషణ శిఖరం యొక్క శోషణ తరంగదైర్ఘ్యం.

తరువాత, ప్రతి సూచిక యొక్క పాత్ర గురించి మాట్లాడుదాం.A260 కోసం, ఇది న్యూక్లియిక్ ఆమ్లం యొక్క దిగుబడిని కొలవడానికి ఉపయోగించవచ్చు.OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml ఉన్నప్పుడు.

స్వచ్ఛత కోసం, మనం సాధారణంగా చూసే నిష్పత్తులను చూడాలి: OD260/280 మరియు OD260/230.
స్వచ్ఛమైన DNA: OD260/280 దాదాపు 1.8కి సమానం.1.9 కంటే ఎక్కువ ఉంటే ఆర్‌ఎన్‌ఏ కాలుష్యం ఉందని, 1.6 కంటే తక్కువ ఉంటే ప్రొటీన్ మరియు ఫినాల్ కాలుష్యం ఉందని సూచిస్తుంది.
స్వచ్ఛమైన RNA: 1.7
·OD260/230: అది DNA లేదా RNA అయినా, సూచన విలువ 2.5.ఇది 2.0 కంటే తక్కువగా ఉన్నప్పుడు, చక్కెర, ఉప్పు మరియు సేంద్రీయ పదార్థాల కాలుష్యం ఉందని సూచిస్తుంది.

RNA సమగ్రత

RNA యొక్క సమగ్రతను కొలవడం చాలా ముఖ్యం.సాధారణంగా, 28S మరియు 18S RNA మధ్య ప్రకాశం రెండు రెట్లు సంబంధాన్ని కలిగి ఉందో లేదో తనిఖీ చేయడానికి RNA డీనాటరేషన్ జెల్ ప్రయోగం చేయడం అవసరం.మూడవ బ్యాండ్ 5S కనిపించినప్పుడు, అకశేరుకాలు మినహా RNA క్షీణించడం ప్రారంభించిందని అర్థం.

RNA నాణ్యత అంచనా కోసం డేటా: పై పరీక్షలకు అదనంగా, RNA సమగ్రత పరంగా మరికొన్ని అధునాతన పరికర పరీక్షలు కూడా ఉన్నాయి, ఎక్స్‌పెరియన్ ఆటోమేటిక్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ సిస్టమ్ యొక్క RQI సమగ్రత పరీక్ష వంటివి, RNA అదృశ్యంగా క్షీణించిందో లేదో గుర్తించగలదు.

శాస్త్రీయ పరిశోధనలో, ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR అనేది లక్ష్య జన్యువు మరియు అంతర్గత సూచన జన్యువు మధ్య పోలిక.కాబట్టి, RNA నమూనా సంరక్షణ, RNA వెలికితీత మొదలైన ప్రక్రియలో, RNA యొక్క సమగ్రతను నిర్ధారించడం ప్రాథమిక లక్ష్యం.

లక్ష్య జన్యువు మరియు అంతర్గత సూచన జన్యువు మధ్య సంతులనాన్ని RNA యొక్క సమగ్రత ఎలా ప్రభావితం చేస్తుందో దిగువ బొమ్మ నుండి సులభంగా అర్థం చేసుకోవచ్చు.క్షీణత జన్యు అసంపూర్ణతకు దారి తీస్తుంది, ఇది అంతర్గత సూచన జన్యువు యొక్క అసంపూర్ణత లేదా లక్ష్య జన్యువు యొక్క అసంపూర్ణత, ఇది డేటాపై గొప్ప ప్రభావాన్ని చూపుతుంది.

లక్ష్య జన్యువు మరియు సూచన జన్యువు యొక్క స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం తప్పక నిజం కాకూడదు

నిరోధక పరీక్ష (CT విలువ అధిక లేదా తక్కువ ఏకాగ్రత లేదా ఇతర పరిస్థితులలో అణచివేయబడినా)

ఈ బొమ్మను ఉదాహరణగా తీసుకుంటే, ఐదు వక్రరేఖల Ct విలువలు క్రింది విధంగా ఉన్నాయి.వక్రరేఖల మధ్య CT విలువల పంపిణీ అసమానంగా ఉంటుంది మరియు Ct విలువలు అధిక మరియు తక్కువ సాంద్రతలలో ఆలస్యం అవుతాయి, ఇది PCR నిరోధానికి సంబంధించినది.

ముఖ్య విషయం: RNA వెలికితీత ప్రక్రియలో, మనం అపోహలను విడిచిపెట్టి సరైన వాటిని స్థాపించాలి.

తప్పుడు ఆలోచన ఏమిటంటే: RNA వెలికితీత అనేది దిగుబడిని మాత్రమే కొనసాగిస్తుంది, RNA ఎంత పెద్ద మొత్తంలో పొందితే అంత మంచిదని భావిస్తారు.నిజానికి, మనం పరిమాణీకరణ చేసినప్పుడు, జన్యువుల సంఖ్య చాలా పెద్దది కానట్లయితే, మనకు ఎక్కువ RNA అవసరం లేదు.మీరు సంగ్రహించే RNA మొత్తం తగినంత కంటే ఎక్కువ.

సరైన భావన:RNA వెలికితీత స్వచ్ఛత, సమగ్రత మరియు స్థిరత్వాన్ని కొనసాగించాలి.స్వచ్ఛత తదుపరి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ నిరోధించబడదని మరియు DNA ద్వారా డేటా ప్రభావితం కాదని నిర్ధారిస్తుంది.సమగ్రత లక్ష్య క్రమాలు మరియు అంతర్గత సూచనల సమతుల్యతను నిర్ధారిస్తుంది.స్థిరత్వం స్థిరమైన నమూనా లోడింగ్‌ను నిర్ధారిస్తుంది.

MIQE (4) - రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్
అపోహ: అధిక నమూనా వాల్యూమ్ యొక్క సాధన.
సరైన భావన: లోడ్ చేయబడిన RNA మొత్తంతో సంబంధం లేకుండా స్థిరత్వం (స్థిరత్వం) కొనసాగించండి, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ యొక్క సామర్థ్యం స్థిరంగా ఉంటుంది, cDNAలో తేడాలు నిజంగా mRNAలో వ్యత్యాసాలను ప్రతిబింబించగలవని నిర్ధారిస్తుంది.
మేము ఈ ప్రక్రియను స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రంతో వివరిస్తాము:

రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ సామర్థ్యం యొక్క స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం, నిజం కాదు
అన్నింటిలో మొదటిది, రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ప్రక్రియ మరియు PCR ప్రక్రియ మధ్య వ్యత్యాసాన్ని మనం అర్థం చేసుకోవాలి.PCR బహుళ హీటింగ్ మరియు ఎనియలింగ్ ప్రక్రియలకు లోనవుతుంది మరియు లక్ష్య భాగం విపరీతంగా పెరుగుతుంది;రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ఈ ప్రక్రియను కలిగి లేనప్పటికీ, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ వాస్తవానికి రెప్లికేషన్ ప్రక్రియలో ఒకదానికొకటి, RNA యొక్క అనేక ముక్కలుగా ఉంటుందని మనం ఊహించవచ్చు.

cDNA సమాచారం యొక్క అనేక ముక్కలు ఉన్నందున, ఇది ఇప్పుడు అర్థం చేసుకోవాలి, ఎందుకంటే పెద్ద మరియు చిన్న శకలాలు రివర్స్-ట్రాన్స్క్రిప్ట్ చేయబడ్డాయి మరియు ఒక భాగంపై దృష్టి పెట్టడం అసాధ్యం.మరియు RNA మొత్తం సాపేక్షంగా తక్కువగా ఉన్నందున, పొందిన cDNA మొత్తం కూడా PCR వలె కాకుండా చాలా తక్కువగా ఉంటుంది, ఇది యాంప్లిఫికేషన్ ప్రభావాన్ని కలిగి ఉంటుంది, కాబట్టి దీనిని గుర్తించడం ప్రాథమికంగా అసాధ్యం.

cDNA ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ఫలితాలు
రెండవది, ఆదర్శవంతంగా, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ఒకదానికొకటి నిర్వహించబడుతుంది, అయితే ఏ కంపెనీ నుండి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ ఈ ప్రభావాన్ని సాధించలేదు.ప్రాథమికంగా, చాలా రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్‌ల సామర్థ్యం 30-50% మధ్య తిరుగుతుంది.ఇదే జరిగితే, మనం సాపేక్షంగా స్థిరమైన రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉంటాము, ఇది మనం చిత్రంలో చూడాలనుకుంటున్నాము: 3 RNAలు 2 cDNAలను పొందుతాయి, 6 RNAలు 4 cDNAలను పొందుతాయి, కాబట్టి ఎంత నమూనా లోడ్ చేయబడినా, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సామర్థ్యం సాపేక్షంగా స్థిరంగా ఉంటుంది.రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సామర్థ్యం అస్థిరంగా మరియు అధిక ఏకాగ్రత నిరోధించబడే పరిస్థితిని మేము చూడకూడదనుకుంటున్నాము.

కాబట్టి, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సామర్థ్యం స్థిరంగా ఉందో లేదో ఎలా ధృవీకరించాలి?పద్ధతి చాలా సులభం, మీరు కేవలం ఒక పోలిక పరీక్ష మాత్రమే చేయాలి: ఒకటి RNA యొక్క పలుచనను రెట్టింపు చేసిన తర్వాత cDNA లోకి రివర్స్ లిప్యంతరీకరణ, మరియు రెండవది cDNA లోకి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ తర్వాత రెట్టింపు పలుచన చేయడం, ఆపై పొందిన వాలు స్థిరంగా ఉందా అని చూడటానికి qPCR చేయండి.అగ్రశ్రేణి విద్యార్థిగా, మీరు దానిని సెకన్లలో అర్థం చేసుకోవాలి.క్రింద చూపిన విధంగా:

రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ యొక్క సామర్థ్యం స్థిరంగా ఉందో లేదో పరీక్షించడానికి RNA మరియు cDNA యొక్క పలుచన
రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ మరియు కిట్
ఖచ్చితమైన ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR అద్భుతమైన రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ మరియు కిట్‌ను ఎలా కలిగి ఉంటుంది.రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ మూలం ప్రకారం సుమారుగా రెండు రకాలుగా విభజించబడింది, AMV లేదాM-MLV, మరియు వారి పనితీరు పట్టికలో చూపిన విధంగానే ఉంటుంది.

RNase H కార్యాచరణ
RNase H అనేది Ribonuclease H, చైనీస్ పేరు ribonuclease H, ఇది DNA-RNA హైబ్రిడ్ గొలుసులో RNAను ప్రత్యేకంగా హైడ్రోలైజ్ చేయగల ఎండోరిబోన్యూక్లీస్.RNase H సింగిల్-స్ట్రాండ్ లేదా డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA లేదా RNAలో ఫాస్ఫోడీస్టర్ బంధాలను హైడ్రోలైజ్ చేయదు, అంటే, ఇది సింగిల్ స్ట్రాండెడ్ లేదా డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA లేదా RNAని జీర్ణించుకోదు.cDNA యొక్క రెండవ స్ట్రాండ్ యొక్క సంశ్లేషణలో సాధారణంగా ఉపయోగించబడుతుంది.

ఇదొక విచిత్రం.రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్‌లో RNase H కార్యాచరణ ఉందని మేము చెబుతున్నాము, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ RNase Hని కలిగి ఉందని కాదు మరియు RNase Hని రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ నుండి వేరు చేయడం సాధ్యం కాకపోవచ్చు, బహుశా రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్‌లోని కొన్ని సమూహాల కన్ఫర్మేషన్ కారణంగా ఈ కార్యాచరణ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ వల్ల సంభవించవచ్చు.

అందువల్ల, AMV యొక్క అధిక రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సామర్థ్యంతో సంబంధం లేకుండా, దాని RNase H కార్యాచరణ cDNA దిగుబడిని తగ్గిస్తుంది.వాస్తవానికి, cDNA దిగుబడిని పెంచడానికి వీలైనంత వరకు రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్‌లో RNase H కార్యాచరణను తొలగించడానికి రియాజెంట్ తయారీదారులు నిరంతరం తమ ఉత్పత్తులను ఆప్టిమైజ్ చేస్తున్నారు.
ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత

వివిధ ఉష్ణోగ్రతల వద్ద RNA యొక్క ద్వితీయ నిర్మాణం
వేర్వేరు ఉష్ణోగ్రతల వద్ద RNA యొక్క ద్వితీయ నిర్మాణం కోసం పైన ఉన్న బొమ్మను చూడండి మరియు నిర్దిష్ట ఉష్ణోగ్రత మరియు ఉప్పు సాంద్రత పరిస్థితులలో లక్ష్య భాగం యొక్క ద్వితీయ నిర్మాణాన్ని నిర్ణయించడానికి mFold ఆన్‌లైన్ సాధనాన్ని ఉపయోగించండి.55°C వద్ద, RNA యొక్క ద్వితీయ నిర్మాణం ఇప్పటికీ చాలా క్లిష్టంగా ఉంటుంది, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ పనిచేయదు మరియు 65°C వరకు ద్వితీయ నిర్మాణం పూర్తిగా పరిష్కరించబడదు, అయితే AMV మరియు M-MLV యొక్క వాంఛనీయ ఉష్ణోగ్రత ఈ ఉష్ణోగ్రత కంటే చాలా తక్కువగా ఉంటుంది.
ఏం చేయాలి?సెకండరీ స్ట్రక్చర్ అనేది టెంప్లేట్ యొక్క పరిపూరకరమైన జత, ఇది ప్రైమర్ మరియు రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ మరియు టెంప్లేట్ మధ్య బలమైన పోటీకి దారి తీస్తుంది, దీని ఫలితంగా తక్కువ E మరియు పేలవమైన పునరావృతత వంటి సమస్యల శ్రేణి ఏర్పడుతుంది.

ఏం చేయాలి?ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను వీలైనంత వరకు మాత్రమే పెంచండి.

చాలా మంది రియాజెంట్ తయారీదారులు జన్యు ఇంజనీరింగ్ ద్వారా తమ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్‌ను మెరుగుపరుస్తున్నారు.కొన్ని జిఫాన్ మరియు ఐడెలై వంటి ప్రతిచర్య ఉష్ణోగ్రతను పెంచుతాయి మరియు కొన్ని ఎంజైమ్ మరియు RNA టెంప్లేట్ మధ్య అనుబంధాన్ని మెరుగుపరచడానికి RNase H ఎంజైమ్ యొక్క క్రియాశీల సమూహాన్ని తొలగిస్తాయి.హై అఫినిటీ అనేది సెకండరీ స్ట్రక్చర్‌ను స్పర్ధాత్మకంగా పిండవచ్చు మరియు సజావుగా చదవగలదు మరియు రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ యొక్క సామర్థ్యాన్ని కూడా బాగా మెరుగుపరుస్తుంది.
ముఖ్య విషయం: రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సామర్థ్యం యొక్క స్థిరత్వాన్ని కొనసాగించడానికి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ చాలా ముఖ్యమైనది (ఎంజైమ్‌లు సమర్థవంతంగా ఉండటమే కాకుండా స్థిరంగా కూడా ఉండాలి), లోడ్ చేయబడిన నమూనా మొత్తం కంటే, ఇది ప్రత్యేకంగా పెద్ద-స్థాయి ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR కాకపోతే, అది అస్సలు సాధ్యం కాదు.బహుళ cDNAలు.
వివిధ తయారీదారులు కూడా స్థిరత్వం కోసం కొన్ని ప్రయత్నాలు చేశారు.ఉదాహరణకు, చాలా కంపెనీలు ఇప్పుడు రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌ను అమ్మకానికి ప్రామాణిక కిట్‌గా ప్యాక్ చేశాయి, ఇది మంచి ఎంపిక.
ఉదాహరణకు, ఫోర్జీన్ యొక్క RT ఈజీ సిరీస్ కిట్‌లు:

RT ఈజీ I(మొదటి స్ట్రాండ్ cDNA సింథసిస్ కిట్ కోసం మాస్టర్ ప్రీమిక్స్)

MIQE (5) – లక్ష్యం జన్యు సమాచారం

పై బొమ్మ వివరిస్తుంది
1. ఈ జన్యువు పునరావృత ప్రయోగాలకు ప్రభావవంతంగా ఉందో లేదో సాధారణంగా పునరావృత ప్రయోగాల ద్వారా ధృవీకరించవచ్చు.
2. జీన్ ID, మీకు తెలుసా.
3. జన్యు పొడవు, లక్ష్య జన్యువు యొక్క మొత్తం పొడవు ఖచ్చితంగా సమస్య కాదు.ప్రైమర్‌లను డిజైన్ చేస్తున్నప్పుడు, మెరుగైన యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని నిర్ధారించడానికి యాంప్లికాన్ పొడవు 80-200bp మధ్య ఉండేలా చూసుకోండి.
4. సీక్వెన్స్ బ్లాస్ట్ కంపారిజన్ ఇన్ఫర్మేషన్, నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్‌ను నివారించడానికి టార్గెట్ జన్యువును జీన్‌బ్యాంక్‌లో పోల్చడం అవసరం.
5. సూడోజీన్స్ ఉనికి.ఒక సూడోజీన్ అనేది సాధారణ జన్యువును పోలి ఉండే DNA శ్రేణి, కానీ దాని సాధారణ పనితీరును కోల్పోతుంది.ఇది తరచుగా యూకారియోట్ల యొక్క బహుళ-జన్యు కుటుంబంలో ఉంటుంది.ఇది సాధారణంగా ψ ద్వారా సూచించబడుతుంది.ఇది జన్యువులోని నాన్-ఫంక్షనల్ జెనోమిక్ DNA కాపీ, ఇది కోడింగ్ జన్యు శ్రేణికి చాలా పోలి ఉంటుంది., సాధారణంగా లిప్యంతరీకరించబడవు మరియు స్పష్టమైన శారీరక అర్థాన్ని కలిగి ఉండవు.
6. ఎక్సోన్స్ మరియు ఇంట్రాన్‌లకు సంబంధించి ప్రైమర్‌ల స్థానం.ప్రారంభ సంవత్సరాల్లో, మేము DNA కాలుష్యం యొక్క సమస్యను పరిష్కరించినప్పుడు, మేము తరచుగా ప్రైమర్‌లు, ఎక్సోన్‌లు మరియు ఇంట్రాన్‌ల స్థానాలకు శ్రద్ధ చూపుతాము మరియు DNA విస్తరణను నివారించడానికి ఇంట్రాన్‌ల అంతటా ప్రైమర్‌లను రూపొందించడాన్ని సాధారణంగా పరిగణించాము.దయచేసి దిగువన ఉన్న బొమ్మను చూడండి: నలుపు రంగు ఇంట్రాన్‌లను సూచిస్తుంది, వివిధ బ్లూస్ ఎక్సోన్‌లను సూచిస్తాయి, గులాబీ సాధారణ ప్రైమర్‌లను సూచిస్తుంది మరియు ప్రకాశవంతమైన ఎరుపు రంగు ఇంట్రాన్-స్పానింగ్ ప్రైమర్‌లను సూచిస్తుంది.

స్కీమాటిక్, ఎప్పుడూ నిజం కాదు
ఇది ఎంత ఖచ్చితమైన ప్రణాళికగా కనిపిస్తోంది, కానీ వాస్తవానికి, చాలా సందర్భాలలో, ట్రాన్స్-ఇంట్రాన్ ప్రైమర్‌లు ఊహించినంత అద్భుతంగా లేవు మరియు అవి నిర్దిష్ట-కాని విస్తరణకు కూడా కారణమవుతాయి.కాబట్టి DNA కలుషితాన్ని నివారించడానికి ఉత్తమ మార్గం DNA ను పూర్తిగా తొలగించడం.
7. కన్ఫర్మేషన్ ప్రిడిక్షన్.ఈ ఉదాహరణను మళ్లీ ఉపయోగించి, నిర్దిష్ట ఉష్ణోగ్రత మరియు ఉప్పు సాంద్రత వద్ద లక్ష్య భాగం యొక్క ద్వితీయ నిర్మాణాన్ని గుర్తించడానికి mFold ఆన్‌లైన్ సాధనాన్ని ఉపయోగించండి.

వివిధ ఉష్ణోగ్రతల వద్ద RNA యొక్క ద్వితీయ నిర్మాణం
ద్వితీయ నిర్మాణం అనేది టెంప్లేట్ యొక్క పరిపూరకరమైన జత, ఇది ప్రైమర్ మరియు టెంప్లేట్ జత చేయడం మధ్య బలమైన పోటీకి దారి తీస్తుంది మరియు ప్రైమర్ బైండింగ్ అవకాశాలు తక్కువగా ఉంటాయి, ఫలితంగా తక్కువ E మరియు పేలవమైన పునరావృతత వంటి సమస్యల శ్రేణి ఏర్పడుతుంది.సాఫ్ట్‌వేర్ ప్రిడిక్షన్ ద్వారా, సెకండరీ స్ట్రక్చర్ సమస్య లేనట్లయితే, అది గొప్పగా ఉంటుంది.ఉంటే, మా తదుపరి కథనం ఈ సమస్యను ఎలా పరిష్కరించాలో ప్రత్యేకంగా చర్చిస్తుంది.

MIQE (6)-qPCR ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్స్

ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR కోసం, మీరు ప్రతిరోజూ కష్టపడే మొదటి విషయం RNA వెలికితీత, మరియు రెండవది ప్రైమర్ డిజైన్ కావచ్చు.
అన్నింటిలో మొదటిది, మేము ఇప్పటికీ MIQE చెక్‌లిస్ట్ ప్రకారం ప్రైమర్ డిజైన్ గురించి నియమాలను తనిఖీ చేస్తాము.ఇది చాలా సులభం, స్కమ్‌బాగ్‌లు నవ్వగలరు మరియు మేము దానిని ఒకే వాక్యంలో ముగించవచ్చు: ప్రైమర్ ప్రోబ్ యొక్క క్రమం మరియు స్థానం మరియు సవరణ పద్ధతిని కనుగొనండి.ప్రైమర్ ప్యూరిఫికేషన్ పద్ధతి కోసం, ప్రైమర్ సింథసిస్ ప్రస్తుతం చాలా చౌకగా ఉంది, qPCR PAGE మరియు అంతకంటే ఎక్కువ శుద్దీకరణ పద్ధతులకు అర్హమైనది మరియు సంశ్లేషణ పరికరం యొక్క సమాచారం ముఖ్యమైనది కాదు.చాలా మందికి దశాబ్దాలుగా ప్రైమర్‌లు చేస్తున్నారు మరియు సింథసైజర్ ABI3900 అని తెలియదు.
ప్రైమర్ డిజైన్ సూత్రాలకు సంబంధించి, మీరు వాటిని గుర్తుపెట్టుకోవాల్సిన అవసరం లేదు, ఎందుకంటే చాలా ప్రైమర్ డిజైన్ సాఫ్ట్‌వేర్ లేదా ఆన్‌లైన్ సాధనాలు ఈ సమస్యలను (సిఫార్సు చేయబడిన ఆన్‌లైన్ టూల్ primer3.ut.ee/), మరియు 99.999% ప్రైమర్ డిజైన్ మాన్యువల్‌గా చేయలేదు, రచయిత కొన్నిసార్లు వందల కొద్దీ ప్రైమర్‌లను డిజైన్ చేస్తారు, మీరు ఒక్కొక్కటిగా చదివితే.
ప్రైమర్‌లను రూపొందించిన తర్వాత ఈ క్రింది అంశాలను తనిఖీ చేయండి:
1. 3′ ముగింపుకు దగ్గరగా డిజైన్ ప్రైమర్‌లు: cDNA ఫస్ట్-స్ట్రాండ్ సింథసిస్ కోసం ఒలిగో dT ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించే సందర్భంలో, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సామర్థ్యం మరియు RNA సమగ్రతను పరిగణనలోకి తీసుకుంటే, యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని మెరుగుపరచడానికి డిజైన్ చేసిన ప్రైమర్‌లను 3′ ముగింపుకు దగ్గరగా రూపొందించాలి.కింది విధంగా వివరించడానికి చిత్రాన్ని ఉపయోగించండి (దీనిని అర్థం చేసుకోవడానికి మార్గం లేదు):

ప్రైమర్‌లను 3′ ముగింపుకు దగ్గరగా ఎందుకు డిజైన్ చేయాలి, అది నిజం కాకూడదు
2. TM విలువ: Tm విలువ 55-65°C వద్ద ఉంటుంది (ఎందుకంటే ఎక్సోన్యూకలీస్ యాక్టివిటీ అత్యధికంగా 60°C వద్ద ఉంటుంది), మరియు GC కంటెంట్ 40%-60% వద్ద ఉంది.
3. BLAST: జన్యువు యొక్క నిర్దిష్ట-కాని విస్తరణను నివారించడానికి, అనుబంధ ధృవీకరణ కోసం బ్లాస్ట్ తప్పనిసరిగా ఉపయోగించబడాలి.

MIQE(7)—qPCR ప్రక్రియ

1. qPCR కిట్
MIQE యొక్క అవసరాలకు అనుగుణంగా, PCR రియాక్షన్ సిస్టమ్ యొక్క కాన్ఫిగరేషన్, ఏ కిట్ ఉపయోగించబడుతుంది, తయారీదారు ఎవరు, ప్రతిచర్య వ్యవస్థ ఎంత పెద్దది, డై పద్ధతి లేదా ప్రోబ్ పద్ధతిని ఉపయోగించాలా, PCR ప్రోగ్రామ్ సెట్టింగ్‌లతో సహా మేము వ్యాసంలోని పూర్తి ప్రతిచర్య పరిస్థితులను స్పష్టంగా వివరించాలి.కిట్ ఎంపిక చేయబడినంత వరకు, పై సమాచారం ప్రాథమికంగా నిర్ణయించబడిందని అనుభవజ్ఞులైన డ్రైవర్లు ఖచ్చితంగా కనుగొంటారు.
ప్రస్తుతం, ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR కిట్‌ల తయారీ మరియు ఉత్పత్తి చాలా పరిణతి చెందిన సాంకేతికత.మీరు చాలా చెడ్డ తయారీదారులను ఎన్నుకోనంత కాలం, సమస్యల సంభావ్యత ఎక్కువగా ఉండదు, కానీ మేము ఇంకా కొన్ని పాయింట్లను మీతో పంచుకోవాలనుకుంటున్నాము:
హాట్-స్టార్ట్ టాక్ ఎంజైమ్:PCR యొక్క అతి ముఖ్యమైన భాగం హాట్-స్టార్ట్ టాక్ ఎంజైమ్.మార్కెట్‌లోని హాట్-స్టార్ట్ ఎంజైమ్‌లు సాధారణంగా రెండు రకాలుగా విభజించబడ్డాయి, ఒకటి రసాయనికంగా సవరించబడిన హాట్-స్టార్ట్ ఎంజైమ్ (మీరు దీనిని పారాఫిన్ ఎంబెడ్డింగ్‌గా ఊహించవచ్చు), మరియు మరొకటి యాంటీబాడీ సవరణ (యాంటిజెన్-యాంటీబాడీ బైండింగ్) కోసం హాట్-స్టార్ట్ ఎంజైమ్.రసాయన సవరణ అనేది వేడి-ప్రారంభ ఎంజైమ్‌ల ప్రారంభ మార్గం.ఒక నిర్దిష్ట ఉష్ణోగ్రత చేరుకున్నప్పుడు, ఎంజైమ్ దాని కార్యాచరణను విడుదల చేస్తుంది.యాంటీబాడీ-మార్పు చేయబడిన హాట్-స్టార్ట్ ఎంజైమ్ ఎంజైమ్ యొక్క కార్యాచరణను నిరోధించడానికి జీవ పద్ధతులను ఉపయోగిస్తుంది.ఒక నిర్దిష్ట ఉష్ణోగ్రత చేరుకున్నప్పుడు, యాంటీబాడీ డీనాట్ చేయబడుతుంది మరియు ప్రోటీన్ వలె క్రియారహితం చేయబడుతుంది మరియు ఎంజైమ్ కార్యకలాపాలు అమలులోకి తీసుకురాబడతాయి.

అయితే, దీని వల్ల ఉపయోగం ఏమిటి?ఈ సందర్భంలో, యాంటీబాడీ-మార్పు చేసిన ఎంజైమ్‌ల విడుదల చర్య రసాయనికంగా సవరించిన ఎంజైమ్‌ల కంటే వేగంగా ఉంటుంది, కాబట్టి సున్నితత్వం పరంగా, యాంటీబాడీ-మార్పు చేసిన ఎంజైమ్‌లు స్వల్ప ప్రయోజనాన్ని కలిగి ఉంటాయి, తద్వారా మార్కెట్‌లోని కిట్‌లలో ప్రాథమికంగా రసాయనికంగా సవరించిన ఎంజైమ్‌లు లేవు.ఉన్నట్లయితే, ఈ తయారీదారు యొక్క సాంకేతికత ఇప్పటికీ సహస్రాబ్ది యుగంలో చిక్కుకుంది.
మెగ్నీషియం అయాన్ గాఢత:PCR ప్రతిచర్యలో మెగ్నీషియం అయాన్ గాఢత చాలా ముఖ్యమైనది.తగిన మెగ్నీషియం అయాన్ గాఢత టాక్ ఎంజైమ్ కార్యకలాపాల విడుదలను ప్రోత్సహిస్తుంది.ఏకాగ్రత చాలా తక్కువగా ఉంటే, ఎంజైమ్ కార్యకలాపాలు గణనీయంగా తగ్గుతాయి;ఏకాగ్రత చాలా ఎక్కువగా ఉంటే, ఎంజైమ్-ఉత్ప్రేరక నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ మెరుగుపరచబడుతుంది.మెగ్నీషియం అయాన్ల ఏకాగ్రత ప్రైమర్ల ఎనియలింగ్, టెంప్లేట్ మరియు PCR ఉత్పత్తుల యొక్క ద్రవీభవన ఉష్ణోగ్రతను కూడా ప్రభావితం చేస్తుంది, తద్వారా విస్తరించిన శకలాలు దిగుబడిని ప్రభావితం చేస్తుంది.మెగ్నీషియం అయాన్ల సాంద్రత సాధారణంగా 25mM వద్ద నియంత్రించబడుతుంది.వాస్తవానికి, మంచి కిట్ కోసం, మెగ్నీషియం అయాన్ల ఏకాగ్రత బాగా నియంత్రించబడాలి.కొంతమంది వ్యాపారులు రియాజెంట్‌కు మెగ్నీషియం అయాన్ చెలాటింగ్ ఏజెంట్‌ను జోడిస్తారు, ఇది మెగ్నీషియం అయాన్ గాఢత యొక్క స్వయంచాలక సర్దుబాటు ప్రభావాన్ని సాధించగలదు.
ఫ్లోరోసెంట్ డై ఏకాగ్రత:మేము సాధారణంగా ఉపయోగించే SYBR గ్రీన్ అయిన ఫ్లోరోసెంట్ డై, ప్రధానంగా డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA యొక్క చిన్న గాడితో బంధించడం ద్వారా ఫ్లోరోసెన్స్‌ను ఉత్పత్తి చేస్తుంది, ఎందుకంటే డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNAకి డైని బంధించడం నిర్దిష్టంగా ఉండదు, అంటే డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNAతో కలిపినంత కాలం DNAలో ప్రైమర్ సిస్టమ్ ఏర్పడుతుంది. నేపథ్య సిగ్నల్.
PS: దాని కాంతి-సెన్సిటివ్ లక్షణాల కారణంగా, మార్కెట్‌లోని ఉత్పత్తులు సాధారణంగా బ్రౌన్ అపారదర్శక సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లలో ప్యాక్ చేయబడతాయి (క్రింద చిత్రంలో చూపిన విధంగా).అయితే, ఇది ఒక సమస్యను ఎదుర్కొంటుంది.శాంప్లింగ్ చేసేటప్పుడు ద్రవం పీల్చుకుందో లేదో చూడటం కష్టం.ఈ విషయంలో, Qingke నిజానికి అత్యంత యూజర్ ఫ్రెండ్లీ (క్రింద చిత్రంలో చూపిన విధంగా), మరియు పారదర్శక ట్యూబ్ అపారదర్శక టిన్ బ్యాగ్‌లో ప్యాక్ చేయబడింది.కాంతి మరియు నమూనాలను నివారించే సౌలభ్యాన్ని పరిగణనలోకి తీసుకుని, దానిని టిన్ బ్యాగ్‌లో ఉంచండి.మీరు సరైన ఉత్పత్తి సంఖ్యను ఎంచుకోవాలి.TSE204 అనేది చాలా ఖర్చుతో కూడుకున్న అస్తిత్వం, ఇది నాకు గడ్డిని నాటాలనిపిస్తుంది.

ఫ్లోరోసెంట్ డై యొక్క ఏకాగ్రత కూడా చాలా ముఖ్యమైనది.ఏకాగ్రత చాలా తక్కువగా ఉంటే, యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్ తరువాతి దశలో పైకి వెళ్లదు మరియు ఖచ్చితమైనది కాదు;ఏకాగ్రత చాలా ఎక్కువగా ఉంటే, అది శబ్దం అంతరాయం కలిగిస్తుంది.ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR ప్రధానంగా CT విలువపై ఆధారపడి ఉంటుంది కాబట్టి, ఫ్లోరోసెంట్ డై యొక్క ఏకాగ్రత సరిగ్గా సర్దుబాటు చేయకపోతే, తక్కువ పాయింట్ హై పాయింట్ కంటే మెరుగ్గా ఉంటుంది.వాస్తవానికి, తగిన రంగు ఏకాగ్రత ఉత్తమమైనది.

ROX: బాగా-బాగా ఉన్న ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్ లోపాలను సరిచేయడానికి ROX రంగులు ఉపయోగించబడతాయి.కొన్ని పరికరాల తయారీదారులకు క్రమాంకనం అవసరం, మరికొందరికి అవసరం లేదు.ఉదాహరణకు, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్ యొక్క రియల్ టైమ్ PCR యాంప్లిఫికేషన్ పరికరం యొక్క ఉపయోగం సాధారణంగా 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus మొదలైన వాటితో సహా క్రమాంకనం అవసరం. సాధారణ కిట్ సూచనలు దానిని వివరిస్తాయి.
ఫోర్జీన్ యొక్క qPCR మిక్స్ కూడా ROX డైని కలిగి ఉంటుంది, ఇది వివిధ మోడళ్లలో ఉపయోగించడానికి సౌకర్యంగా ఉంటుంది.

రియల్ టైమ్ PCR కిట్-తక్మాన్

బలహీనమైన హైడ్రోజన్ బాండ్ చికిత్స: బలహీనమైన హైడ్రోజన్ బంధాల చికిత్స సాపేక్షంగా సాంకేతిక విషయం.చాలా కిట్‌ల మాన్యువల్‌లను ఏమీ చదవలేదు, కానీ వాటిలో ఏదీ ఈ అంశాన్ని ప్రస్తావించలేదు.నిజానికి, ఇది చాలా ముఖ్యమైనది.స్థావరాల కలయిక ప్రధానంగా హైడ్రోజన్ బంధాల బలం మీద ఆధారపడి ఉంటుంది.బలమైన హైడ్రోజన్ బంధాలు సాధారణ యాంప్లిఫికేషన్, మరియు బలహీనమైన హైడ్రోజన్ బంధాలు నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్‌కు దారితీస్తాయి.బలహీనమైన హైడ్రోజన్ బంధాలను బాగా తొలగించలేకపోతే, నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ నివారించబడదు.రచయిత యొక్క పరిధిలో, కొన్ని కంపెనీలు మాత్రమే ఈ సమస్యను గమనించాయి.మీరు కిట్‌ను కొనుగోలు చేసినప్పుడు, మీరు ఎంచుకోవాలనుకుంటున్న కిట్‌కు సంబంధించి ఈ విషయంలో మీరు పరిష్కారాన్ని పరిగణించారా లేదా అని మీరు సూచించవచ్చు.

ప్రతిచర్య వాల్యూమ్: 20-50ul సిస్టమ్ ఎక్కువగా ఉపయోగించబడుతుంది మరియు చిన్న వాల్యూమ్‌లు లోపాలను కలిగించే అవకాశం ఉంది.సాధారణంగా చెప్పాలంటే, కిట్ సూచనలు PCR ప్రతిచర్య వాల్యూమ్‌లను ఉపయోగించమని సిఫార్సు చేస్తాయి.తెలివిగా ఉండకండి మరియు ఖర్చులను ఆదా చేయడానికి చిన్న వాల్యూమ్‌లను ఉపయోగించండి.యొక్క లక్ష్యం.వ్యాపారులు సిఫార్సు చేసిన వాల్యూమ్ వాస్తవానికి పరీక్షించబడింది మరియు చిన్న వాల్యూమ్‌ల వల్ల ఏర్పడే లోపాల సమస్యను వారు పరిష్కరించలేకపోవచ్చు.
2. ట్యూబ్ ప్లేట్ తయారీదారు మరియు కథనం సంఖ్య
ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR సూత్రం అందరికీ తెలుసు.ఫ్లోరోసెన్స్ సేకరణ ప్రధానంగా PCR ట్యూబ్ క్యాప్స్ ద్వారా నిర్వహించబడుతుంది.PCR వినియోగ వస్తువులను ఎన్నుకునేటప్పుడు, రెండు పాయింట్లకు శ్రద్ద: మంచి కాంతి ప్రసారం మరియు పరికరం కోసం తగినది.సాధారణంగా చెప్పాలంటే, ప్రధాన స్రవంతి బ్రాండ్‌ల బోర్డులు మరియు ట్యూబ్‌లు బాగానే ఉంటాయి, కానీ మీరు అనుసరణ పరంగా జాగ్రత్తగా ఎంచుకోవాలి, లేకుంటే మీరు పరికరాన్ని ఉపయోగించలేరు.

4. ఉన్నత స్థాయి జ్ఞానం

MIQE (8)—qPCR ధ్రువీకరణ
ఇది qPCR యొక్క ప్రధాన ప్రాధాన్యత!చాలా మంది హీరోలు ఇక్కడ ఇసుకలో పడిపోయారు.వాస్తవానికి, మీరు అదృష్టవంతులు మరియు మీరు అధ్యయనం చేసిన జన్యువులు సరళంగా ఉండే అవకాశం ఉంది, కాబట్టి మీరు గాలి వెంట మంచు గుహలో తేలియాడారు.qPCR యొక్క ధృవీకరణ సమాచారం డేటా యొక్క విశ్వసనీయతను పరీక్షించడానికి ఉద్దేశించబడింది.మేము అవసరమైన ధృవీకరణ సమాచారాన్ని ఈ క్రింది విధంగా జాబితా చేస్తాము:

1.ప్రత్యేకత పరీక్ష
ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ చిత్రం ఒకే బ్యాండ్‌గా ఉందో లేదో తనిఖీ చేయడం ద్వారా లక్ష్య జన్యు విస్తరణ యొక్క విశిష్టత పరీక్షించబడుతుంది;సీక్వెన్సింగ్ ధృవీకరణ;పీక్ మ్యాప్ సింగిల్‌గా ఉందో లేదో చూడటానికి మెల్టింగ్ కర్వ్;ఎంజైమ్ జీర్ణక్రియ ధృవీకరణ మరియు ఇతర పద్ధతులు.
ఇక్కడ, మేము t పై దృష్టి పెడతాముఅతను వక్రరేఖలను కరిగించే పద్ధతిని ఉపయోగించి నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ యొక్క విశ్లేషణ.సాధారణంగా చెప్పాలంటే, మేము ప్రైమర్‌లను డిజైన్ చేసినప్పుడు, ఉత్పత్తి భాగం యొక్క పరిమాణం 80-200bp పరిధిలో ఉండాలి, ఇది PCR ఉత్పత్తి యొక్క ద్రవీభవన ఉష్ణోగ్రత 80-85 °C పరిధిని చేస్తుంది.అందువల్ల, ఇతర శిఖరాలు ఉన్నట్లయితే, ఇతర నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తులు ఉండాలి;శిఖరం 80°C కంటే తక్కువగా కనిపిస్తే, అది సాధారణంగా ప్రైమర్ డైమర్‌గా పరిగణించబడుతుంది;శిఖరం 85°C కంటే ఎక్కువగా కనిపిస్తే, అది సాధారణంగా DNA కాలుష్యం లేదా పెద్ద శకలాల యొక్క మరింత నాన్‌స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్‌గా పరిగణించబడుతుంది.
గమనిక: కొన్నిసార్లు 80°C వద్ద ఒకే ఒక్క శిఖరం మాత్రమే ఉంటుంది.ఈ సమయంలో, ఈ భావనకు కట్టుబడి ఉండాలి.యాంప్లిఫికేషన్ ఫలితాలు అన్నీ ప్రైమర్ డైమర్‌లుగా ఉండే అవకాశం ఉంది.

సాధారణ ద్రవీభవన వక్రరేఖ (నిర్దిష్ట కాని విస్తరణ లేకుండా ఒకే శిఖరం)

సమస్యాత్మక ద్రవీభవన వక్రత (నకిలీ శిఖరాల యొక్క నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్)
【కేసు విశ్లేషణ】

ఒక ప్రధాన శిఖరం ఉంది, కానీ ప్రైమర్ డైమర్ తీవ్రంగా ఉంది
దిగువ చిత్రంలో ఉన్న సింగిల్-పీక్ మెల్టింగ్ కర్వ్ మీ కళ్ళను సులభంగా మోసగించగలదు, ఇది ఒక ఖచ్చితమైన ప్రయోగం అని అనుకుంటుంది, కానీ ఫలితం పూర్తిగా తప్పు.ఈ సమయంలో, మేము ద్రవీభవన ఉష్ణోగ్రతను చూడాలి.గరిష్ట ఉష్ణోగ్రత 80 ° C కంటే తక్కువగా ఉంటుంది, ఇది పూర్తిగా ప్రైమర్-డైమర్.

లక్ష్య భాగం లేదు, అన్ని ప్రైమర్ డైమర్‌లు
ఇక్కడ, నా సోదరుడు ఆపలేడు.క్రింద ఉన్న చిత్రం ఒక చెత్తబుట్ట నాకు పంపిన మొబైల్ ఫోన్‌తో తీసిన ఫోటో.అతను ఉపయోగించిన కారకాలు పరిశ్రమలో సాధారణంగా ఉపయోగించే బ్రాండ్‌లు.అతను ఒక T-ప్రిఫిక్స్ బ్రాండ్ నుండి మరొక T-ప్రిఫిక్స్ బ్రాండ్‌కి మారాడు.మీరు ఇప్పటికే ఊహించారని నేను అనుకుంటున్నాను.స్కంబాగ్ నాతో ఇలా అరిచాడు: “మొదటి చిత్రంలో ఉపయోగించిన రియాజెంట్ చాలా బాగుంది మరియు శిఖరం ఒకే విధంగా ఉంది.తర్వాత, మీరు సిఫార్సు చేసిన రియాజెంట్‌ని ఉపయోగించిన తర్వాత, అది మిశ్రమ శిఖరాలతో రెండవ చిత్రం వలె మారుతుంది.నువ్వు నన్ను దుఃఖానికి గురి చేశావు."
రెండు గ్రాఫ్‌లను వేరు చేయండి.మొదటి చూపులో, ఒకదానికి ఒకే శిఖరం, మరొకటి డబుల్ శిఖరం.అర్ధంలేనిది, ఒకే శిఖరం ఖచ్చితంగా ఉంది.అది నిజమా?
Dou E కంటే అధ్వాన్నంగా, నేను క్రింద ఉన్న చిత్రంలో రెండు చిత్రాలను ఉంచినట్లయితే, మీకు వెంటనే అర్థం అవుతుంది.నిజానికి, ఈ రకమైన చిత్రం ద్వారా మనం సులభంగా పక్షవాతానికి గురవుతాము.జాగ్రత్తగా విశ్లేషణ తర్వాత, మేము కనుగొన్నాము: మొదటి వ్యక్తి యొక్క గరిష్ట స్థాయి 75 ° C వద్ద ఉంటుంది, ఇది పూర్తిగా ప్రైమర్ డైమర్;రెండవ సంఖ్య యొక్క శిఖరం 75°C మరియు 82°C వద్ద కనిపిస్తుంది, కనీసం అక్కడ ఉత్పత్తి కనిపిస్తుంది.

విద్యార్థుల నుండి ఫీడ్‌బ్యాక్ చిత్రాలు
కాబట్టి ప్రాథమిక సమస్య రియాజెంట్ల సమస్య కాదు, ప్రైమర్ డిజైన్ సమస్య.అదే సమయంలో, కొన్ని పెద్ద బ్రాండ్‌లు ఇనుము నాణ్యతతో లేవని కూడా ఇది రుజువు చేస్తుంది మరియు నా సోదరుడు ఇంతకు ముందు చెప్పినదానిని కూడా ఇది రుజువు చేస్తుంది: ఇది మీ కథనానికి మద్దతు ఇచ్చే రియాజెంట్ బ్రాండ్ కాదు.రియాజెంట్‌ల బ్రాండ్‌ను ప్రోత్సహించింది మీ కథనం.స్కంబాగ్ రియాజెంట్‌లను మార్చకపోతే, తప్పు డేటా పత్రికకు పంపబడుతుంది మరియు ఏమి జరుగుతుందో ఒక విషాదం అని ఊహించుకోండి.
2. ఖాళీ నియంత్రణ యొక్క Ct విలువ
వివరించవద్దు, ఖాళీ నియంత్రణకు Ct విలువ ఉంటే, అది కాలుష్యం కాదా?అయినప్పటికీ, ఏ ఖాళీ నియంత్రణ Ct విలువను కలిగి ఉందో మీరు ఇంకా అర్థం చేసుకోవాలి.ఇది NTC అయితే, రియాజెంట్ కాలుష్యం వంటి విదేశీ DNA ఉందని అర్థం.అది NRT అయితే, వెలికితీసిన RNAలో DNA కాలుష్యం ఉందని అర్థం.
3. ప్రామాణిక వక్రత
వాలు మరియు గణన సూత్రంతో సహా, PCR సామర్థ్యాన్ని ఫార్ములా ద్వారా లెక్కించవచ్చు.ఖచ్చితమైన ప్రయోగానికి ప్రామాణిక వక్రరేఖ యొక్క వాలు 3.32కి చేరుకోవాలి మరియు R² 0.9999కి చేరుకోవాలి.
4. లీనియర్ డైనమిక్ పరిధి
ప్రతిచర్య యొక్క డైనమిక్ పరిధి సరళంగా ఉంటుంది.ప్రామాణిక వక్రరేఖను రూపొందించడానికి ఉపయోగించే టెంప్లేట్ ప్రకారం, డైనమిక్ పరిధిలో కనీసం 5 ఏకాగ్రత ప్రవణతలు ఉండాలి మరియు అధిక సాంద్రత ప్రవణతలు మరియు తక్కువ గాఢత ప్రవణతలు వద్ద Ct విలువల మార్పుపై శ్రద్ధ వహించాలి.
5. డిటెక్షన్ ఖచ్చితత్వం
qPCR ఫలితాలలో మార్పులు, అంటే, పేలవమైన పునరావృతత, అంటే పేలవమైన ఖచ్చితత్వం, ఉష్ణోగ్రత, ఏకాగ్రత మరియు ఆపరేషన్‌తో సహా అనేక కారణాల వల్ల సంభవిస్తాయి.qPCR ఖచ్చితత్వం సాధారణంగా కాపీ సంఖ్య తగ్గినప్పుడు తక్కువ నియంత్రణలో ఉంటుంది.ఆదర్శవంతంగా ప్రయోగాత్మక వైవిధ్యంలో, ఈ సాంకేతిక వైవిధ్యం జీవ వైవిధ్యం నుండి భిన్నంగా ఉండాలి మరియు జీవ ప్రతిరూపాలు సమూహాలు లేదా చికిత్సల మధ్య qPCR ఫలితాలలో గణాంక వ్యత్యాసాలను నేరుగా పరిష్కరించగలవు.ప్రత్యేకించి రోగనిర్ధారణ పరీక్షల కోసం, సైట్‌లు మరియు ఆపరేటర్‌లలో అత్యుత్తమ ఇంటర్-అస్సే ఖచ్చితత్వం (పునరావృతత) తప్పనిసరిగా నివేదించబడాలి.
6. గుర్తింపు సామర్థ్యం మరియు LOD (మల్టీప్లెక్స్ qPCRలో)
LOD అనేది 95% పాజిటివ్ శాంపిల్స్‌లో అత్యల్ప సాంద్రత.మరో మాటలో చెప్పాలంటే, లక్ష్య జన్యు ప్రతిరూపాల సమితిలో ఉన్న LOD యొక్క ఏకాగ్రత విఫలమైన ప్రతిచర్యలలో 5% మించకూడదు.మల్టీప్లెక్స్ qPCR విశ్లేషణ చేస్తున్నప్పుడు, ప్రత్యేకించి పాయింట్ మ్యుటేషన్‌లు లేదా పాలిమార్ఫిజమ్‌లను ఏకకాలంలో గుర్తించడం కోసం, మల్టీప్లెక్స్ qPCR ఒకే ట్యూబ్‌లో బహుళ లక్ష్య శకలాలు యొక్క ఖచ్చితత్వం రాజీపడదని రుజువును అందించాలి, బహుళ గుర్తింపు మరియు సింగిల్ ట్యూబ్ గుర్తింపు సామర్థ్యం మరియు LOD ఒకే విధంగా ఉండాలి.ప్రత్యేకించి అధిక-ఏకాగ్రత లక్ష్య జన్యువులు మరియు తక్కువ-ఏకాగ్రత లక్ష్య జన్యువులు ఏకకాలంలో విస్తరించబడినప్పుడు, ఈ సమస్యపై శ్రద్ధ వహించాలి.
సమస్యలు మరియు పరిష్కారాలుసాధారణంగా చెప్పాలంటే, qPCR డీబగ్గింగ్‌లో తరచుగా ఎదురయ్యే సమస్యలు క్రింది అంశాలపై దృష్టి పెడతాయి:
· నాన్ స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్
ప్రైమర్ ఏకాగ్రత యొక్క కష్టమైన ఎంపిక మరియు ప్రైమర్-డైమర్‌లతో ఇబ్బంది
· ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత సరికాదు
· సెకండరీ నిర్మాణం యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని ప్రభావితం చేస్తుంది
నాన్‌స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్
నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్సంభవిస్తుంది , ప్రైమర్ డిజైన్ తగినది కాదా అనేది సాధారణంగా పరిగణించబడుతుంది, కానీ మీరు ప్రైమర్‌లను మార్చడానికి తొందరపడకపోతే, మీరు ముందుగా ఈ క్రింది పద్ధతులను ప్రయత్నించవచ్చు (సూత్రం కూడా జోడించబడింది):
· ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను పెంచండి - బలహీనమైన హైడ్రోజన్ బంధాలను నిర్వహించలేని విధంగా చేయడానికి ప్రయత్నించండి;
ఎనియలింగ్ మరియు పొడుగు సమయాన్ని తగ్గించండి - బలహీనమైన హైడ్రోజన్ బంధాల అవకాశాన్ని తగ్గించండి;
· ప్రైమర్ ఏకాగ్రతను తగ్గించండి - అనవసరమైన ప్రైమర్‌లు మరియు లక్ష్యం కాని ప్రాంతాలను బంధించే అవకాశాన్ని తగ్గించండి;
తక్కువ యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం
నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్‌కు వ్యతిరేక పరిస్థితి – తక్కువ యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం , మరియు తక్కువ యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని ఎదుర్కోవడానికి చర్యలు దీనికి విరుద్ధంగా ఉన్నాయి:
· ఎనియలింగ్ మరియు పొడిగింపు సమయాన్ని పొడిగించండి;
·మూడు-దశల PCRకి మార్చండి మరియు ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను తగ్గించండి;
· ప్రైమర్ ఏకాగ్రతను పెంచండి;
Ps: 90వ దశకంలో జన్మించిన చాలా మంది గ్రాడ్యుయేట్ విద్యార్థులు ప్రయోగాలను ఎలా డీబగ్ చేయాలో అధ్యయనం చేయడానికి ఇష్టపడరు మరియు కిట్ సమస్యను పూర్తిగా పరిష్కరిస్తుందని ఆశిస్తున్నాము (మీరు గ్రాడ్యుయేషన్ తర్వాత రీసెర్చ్ అండ్ డెవలప్‌మెంట్ చేయడానికి మీరు రీజెంట్ కంపెనీకి వెళ్లాలనుకుంటే), వాస్తవానికి, రియాజెంట్ తయారీదారులు కూడా ఈ విధంగానే ఆలోచిస్తారు, ఇది ఒక మూర్ఖత్వం అని నేను ఆశిస్తున్నాను, మీరు దాన్ని పొందినప్పుడు దాన్ని పరిష్కరించవచ్చు. బలహీనమైన H-బాండ్ శోషణ కారకాలు.సమస్యను సులువుగా పరిష్కరించడానికి, బలహీనమైన హైడ్రోజన్ బంధాలను గ్రహించే కారకం ఉందో లేదో తెలుసుకోవడానికి మూర్ఖులు రియాజెంట్ కంపెనీ యొక్క పరిచయాన్ని ఇంకా చదవాలి.
ప్రైమర్ ఏకాగ్రత యొక్క కష్టమైన ఎంపిక మరియు ప్రైమర్-డైమర్‌లతో ఇబ్బంది
పద్ధతి 1: సాధారణంగా చెప్పాలంటే, qPCR కోసం కిట్ సూచనలు సిఫార్సు చేసిన సిస్టమ్‌లు మరియు సిఫార్సు చేసిన ప్రైమర్ సాంద్రతలను కలిగి ఉంటాయి.
పద్ధతి 2: ప్రైమర్ ఏకాగ్రత ప్రవణతను సెట్ చేయడం ద్వారా డీబగ్గింగ్.క్రింద ఉన్న చిత్రం వివరించడానికి ఒక కంపెనీ నుండి దొంగిలించబడింది.దిగువ బొమ్మ మూడు ప్రైమర్ ఏకాగ్రత ప్రవణతలు (100nM, 250nM, 500nM) మరియు నాలుగు టెంప్లేట్ ఏకాగ్రత ప్రవణతలతో (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng) చేసిన ఫ్లోరోసెన్స్ పరిమాణాత్మక ఫలితాలను చూపుతుంది.ప్రయోగాత్మక ఫలితాల యొక్క Ct విలువ క్రింది విధంగా రూపొందించబడింది:

ప్రైమర్ ఏకాగ్రత ఎంపిక ప్రతి ప్రైమర్ ఏకాగ్రతను క్రింది విధంగా ఒక లైన్‌లో కలపండి:

ప్రైమర్ ఏకాగ్రత ఎంపిక స్పష్టంగా ఉంది, 100nM మరియు 250nM యొక్క ప్రైమర్ ఏకాగ్రత యొక్క సరళ సంబంధం ఉత్తమం మరియు 500nM యొక్క ప్రైమర్ ఏకాగ్రత యొక్క సరళ సంబంధం చాలా తక్కువగా ఉంది.100nM మరియు 250nMలలో, 250nM యొక్క Ct విలువ చాలా తక్కువగా ఉంటుంది, కాబట్టి సరైన ప్రైమర్ ఏకాగ్రత 250nM.సాధారణంగా తీవ్రమైన ప్రైమర్-డైమర్‌లను ద్రవీభవన వక్రరేఖలో చూడవచ్చు.డిజైన్ చేయబడిన ప్రైమర్‌లు ప్రైమర్-డైమర్‌లను నివారించలేకపోతే ఏమి చేయాలి?
పద్ధతి 3: ప్రైమర్ల మొత్తాన్ని తగ్గించండి మరియు ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను పెంచండి (వివరించాల్సిన అవసరం లేదు).
ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత యొక్క అనుభావిక విలువ 60 ° C.మీకు ఖచ్చితంగా తెలియకపోతే, మరింత అనుకూలమైన ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను ఎలా ఎంచుకోవాలి?సమాధానం ప్రైమర్ ఏకాగ్రత ఎంపిక వలె ఉంటుంది -ప్రవణత పరీక్ష.సమస్యను వివరించడానికి బయో-రాడ్ కంపెనీ నుండి చిత్రాన్ని తీయండి.నిర్దిష్ట లక్ష్య భాగం యొక్క విస్తరణ కోసం, ఎనిమిది ఉష్ణోగ్రత ప్రవణతలను సెట్ చేయండి, ఒక్కొక్కటి మూడు పునరావృత్తులు మరియు పొందిన యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్ క్రింది విధంగా ఉంటుంది:

ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత ఎంపిక:
·70°C, 69°C-ప్రాథమికంగా, ప్రైమర్‌లను కలపడం సాధ్యం కాదు, కాబట్టి విస్తరణ ఉండదు.
· 67.3°C – ప్రారంభంలో కొద్ది మొత్తంలో యాంప్లిఫికేషన్ ఉంది మరియు Ct విలువ సాపేక్షంగా పెద్దది.
·64.5°C——Ct విలువ తగ్గుతుంది.
60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, మరియు 55.0°C వద్ద, Ct విలువలు ప్రాథమికంగా స్థిరంగా ఉంటాయి, అయితే చివరి ఫ్లోరోసెన్స్ విలువలు భిన్నంగా ఉంటాయి.
ఎలా ఎంచుకోవాలి?సూత్రం: మొదటి సూత్రం అధిక Ct విలువ.అదే Ct విలువ కోసం, డైమెరైజేషన్ మరియు నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్‌ను నివారించడానికి అధిక ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను ఎంచుకోండి.55 ° C వద్ద అధిక ఫ్లోరోసెన్స్ విలువ ఉన్నప్పటికీ, దానిలో డైమర్లు లేదా నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ ఉండవచ్చు.
కానీ మీరు మీలాగే తెలివిగా ఉంటే, మీరు ఖచ్చితంగా ఇలా అనుకుంటారు: తార్కికంగా చెప్పాలంటే, PCR ప్రతిచర్య చాలా నిర్దిష్టంగా ఉంటే, ప్రైమర్ ఏకాగ్రత కనీస అవసరాన్ని మించి ఉన్నంత వరకు, ఫ్లోరోసెంట్ రంగులు మరియు dNTPల వలె అధిక మరియు తక్కువ పాయింట్లు ఎటువంటి ప్రభావాన్ని కలిగి ఉండవు.నిజానికి, ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత సరిగ్గా ఆప్టిమైజ్ చేయబడినంత వరకు, Ct విలువపై ప్రైమర్ ఏకాగ్రత ప్రభావం సహజంగానే తగ్గించబడుతుంది.

ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత సరిగ్గా ఆప్టిమైజ్ చేయబడింది మరియు CT పై ప్రైమర్ ఏకాగ్రత ప్రభావం తగ్గించబడుతుంది
ద్వితీయ నిర్మాణం యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని ప్రభావితం చేస్తుంది
సమస్యను వివరించడానికి బయో-రాడ్ నుండి చిత్రాన్ని తీసుకుందాం.ద్వితీయ నిర్మాణంతో జన్యువును విస్తరించేందుకు ఇది ఉష్ణోగ్రత ప్రవణతను కూడా రూపొందిస్తుంది.

ద్వితీయ నిర్మాణం ఉద్భవించింది
ఉష్ణోగ్రత ప్రవణత తగ్గినప్పుడు, ఉత్పత్తులు కనిపించడం ప్రారంభమవుతుంది మరియు Ct విలువ ముందుకు కదులుతుంది, కనిష్ట విలువ 60.7 ° Cకి చేరుకుంటుంది, ఆపై ఉష్ణోగ్రత ప్రవణత తగ్గినప్పుడు, Ct విలువ పెద్దదిగా మారుతుంది.దీనికి విరుద్ధంగా, ఉష్ణోగ్రత పెరిగేకొద్దీ, ద్వితీయ నిర్మాణం తెరుచుకుంటుంది మరియు యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం పెరుగుతుంది.నిర్దిష్ట ఉష్ణోగ్రతకు చేరుకున్న తర్వాత, ఉష్ణోగ్రతను పెంచడం వల్ల యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని మెరుగుపరచలేము.ఎందుకంటే ఈ సమయంలో ప్రైమర్‌లను స్థిరంగా కలపడం సాధ్యం కాదు.అందువలన,అత్యల్ప Ct విలువతో ఉష్ణోగ్రత కోసం చూడండి, సెకండరీ స్ట్రక్చర్ టెంప్లేట్‌ని విస్తరించడానికి ఇది ఉత్తమ ఉష్ణోగ్రత!వాస్తవానికి, స్మార్ట్ ఫూల్స్ తప్పనిసరిగా తెలుసుకోవాలి, ఇది అవసరం లేకపోతే, ప్రైమర్‌లను మార్చడం మరియు ద్వితీయ నిర్మాణ ప్రాంతాన్ని నివారించడం ఉత్తమం.
5. అప్లికేషన్ స్థాయి
MIQE-డేటా విశ్లేషణ

డేటా విశ్లేషణ ప్రధానంగా ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR పరికరం ద్వారా ఇవ్వబడుతుంది.మునుపటి వ్యాసంలో, ప్రయోగం రూపకల్పనలో వివరించబడిన ఖాళీ నియంత్రణ వంటి డేటా విశ్లేషణ పని చాలా జరిగింది.అంతర్గత సూచన జన్యువులు, పునరావృత సంఖ్యలు మొదలైనవి స్పష్టం చేయబడ్డాయి., ఇక్కడ మేము ప్రధానంగా qPCR యొక్క అనువర్తనాన్ని వివరిస్తాము.
qPCR విస్తృతంగా ఉపయోగించబడుతుంది మరియు ప్రయోగాత్మక ధృవీకరణ మరియు న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ నిర్ధారణ అత్యంత సాధారణంగా ఉపయోగించే దృశ్యాలు.
సంపూర్ణ పరిమాణీకరణ
లాగ్ (ప్రారంభ ఏకాగ్రత) చక్రాల సంఖ్యతో సరళ సంబంధాన్ని కలిగి ఉంటుంది.తెలిసిన ప్రారంభ కాపీ సంఖ్యతో ప్రమాణం నుండి ఒక ప్రామాణిక వక్రరేఖను గీయవచ్చు, అనగా యాంప్లిఫికేషన్ ప్రతిచర్య యొక్క సరళ సంబంధాన్ని పొందవచ్చు.నమూనా యొక్క Ct విలువ ప్రకారం, నమూనాలోని ఏకాగ్రతను లెక్కించవచ్చు.చేర్చాల్సిన టెంప్లేట్‌ల మొత్తం.

సంపూర్ణ పరిమాణాత్మక గణన పద్ధతి
సంపూర్ణ పరిమాణీకరణ తప్పనిసరిగా ప్రామాణిక వక్రరేఖపై ఆధారపడి ఉండాలి.ప్రామాణిక వక్రత చేయడానికి, ఒక ప్రమాణం అవసరం.సాధారణంగా, లక్ష్య జన్యువును క్లోనింగ్ చేయడం ద్వారా పొందిన ప్లాస్మిడ్ ప్రమాణం.ఇది ప్లాస్మిడ్ ఎందుకు?ఎందుకంటే వృత్తాకార ప్లాస్మిడ్ DNA అత్యంత స్థిరంగా ఉంటుంది.రెట్టింపు నిష్పత్తి (10 రెట్లు పలుచన) ప్రకారం ప్రామాణిక ఉత్పత్తిని 5 నుండి 6 ప్రవణతలలో కరిగించండి మరియు పలుచన చేసేటప్పుడు ఏకరూపతకు శ్రద్ధ వహించండి.Ct విలువ 15-30 మధ్య పడిపోనివ్వండి.

ప్రామాణిక తయారీ
అదే సమయంలో, పరీక్షించాల్సిన నమూనా కూడా తదనుగుణంగా పలుచన చేయాలి (పలచన కారకాన్ని గుర్తుంచుకోండి), మరియు Ct విలువ కూడా 15-30 మధ్య తగ్గాలి.ప్రామాణిక ఉత్పత్తి + పరీక్షించాల్సిన నమూనా కలిసి మెషీన్‌లో ఉంచబడతాయి.పరుగు తర్వాత, ప్రామాణిక పదార్ధంతో ఒక ప్రామాణిక వక్రరేఖ తయారు చేయబడింది మరియు ఏకాగ్రతను లెక్కించడానికి పరీక్షించాల్సిన నమూనాలను ప్రామాణిక వక్రరేఖలోకి తీసుకురాబడింది.
హెపటైటిస్ B వైరస్ HBV పరిమాణీకరణ అనేది ఒక సాధారణ సంపూర్ణ పరిమాణీకరణ, ఇది 1ml రక్తంలో వైరస్ కాపీ సంఖ్యను లెక్కించగలదు.
కాపీ సంఖ్య యొక్క గణన
పరీక్షించాల్సిన నమూనా ఏకాగ్రత (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × పలుచన కారకం
నమూనా పరమాణు బరువు = స్థావరాల సంఖ్య × 324
పరీక్షించాల్సిన నమూనా యొక్క కాపీ సంఖ్య (కాపీలు/ఉల్) = పరీక్షించాల్సిన నమూనా యొక్క ఏకాగ్రత / నమూనా యొక్క పరమాణు బరువు × 6 × 1014

కాపీ సంఖ్య యొక్క గణన పద్ధతి

పైన పేర్కొన్నది పరిమాణాన్ని నిర్ణయించడానికి గణన పద్ధతి.ఇది జూనియర్ హైస్కూల్ నుండి గ్రాడ్యుయేషన్ తర్వాత పరిష్కరించబడే గణిత సమస్య, మరియు గణిత సమస్యలు సాధారణంగా కంప్యూటర్ల ద్వారా పరిష్కరించబడతాయి.మీకు అర్థం కాకపోతే, మీరు కమ్యూనికేట్ చేయడానికి రావచ్చు.
సాపేక్ష పరిమాణీకరణ
సాపేక్ష పరిమాణీకరణ ప్రధానంగా శాస్త్రీయ పరిశోధనలో ఉపయోగించబడుతుంది.1ml రక్తంలో ఎన్ని వైరస్‌లు ఉన్నాయి మరియు ఇది DNA వైరస్, ఇది సాపేక్షంగా నిర్ణయాత్మక సంఘటన: రక్తం మొత్తాన్ని నిర్ణయించవచ్చు మరియు DNA వైరస్ సాపేక్షంగా స్థిరంగా ఉంటుంది.అయినప్పటికీ, ఒక ఆకులోని నిర్దిష్ట జన్యువు యొక్క ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కాపీల సంఖ్యను పోల్చడం మాకు కష్టం, ఎందుకంటే ఆకు యొక్క పరిమాణం, బరువు మరియు సున్నితత్వాన్ని గుర్తించడం కష్టం, సేకరించిన RNA మొత్తాన్ని గుర్తించడం కష్టం మరియు రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సామర్థ్యాన్ని గుర్తించడం కూడా కష్టం, అంటే, ఏ దశలోనూ ప్రయోగాత్మక డేటా ఉపయోగించబడదు.
కాబట్టి, సాపేక్ష పరిమాణీకరణ తప్పనిసరిగా ఒక మూలకాన్ని పరిచయం చేయాలి:అంతర్గత సూచన జన్యువు.
మరో మాటలో చెప్పాలంటే, సాపేక్ష పరిమాణీకరణ అనేది వాస్తవానికి లక్ష్య జన్యువు మరియు అంతర్గత సూచన జన్యువు మధ్య పోలిక.ఒకే కణజాలం మరియు ఒకే కణంతో పోలిస్తే, నమూనా పరిమాణం, RNA వెలికితీత మొత్తం, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సామర్థ్యం మరియు PCR సామర్థ్యం యొక్క ప్రభావం చాలా తక్కువగా ఉంటుంది.చిన్న నమూనా పరిమాణం కారణంగా, అంతర్గత సూచన జన్యువులు మరియు లక్ష్య జన్యువులు రెండూ సాపేక్షంగా తగ్గించబడ్డాయి.అందుకే మేము ఇంతకు ముందు ఏకరూపత మరియు స్థిరత్వాన్ని నొక్కిచెప్పాము.
అంతర్గత సూచన జన్యువులు సాధారణంగా ఉంటాయిగృహనిర్వాహక జన్యువులు(హౌస్ కీపింగ్ జన్యువులు), ఇది అన్ని కణాలలో స్థిరంగా వ్యక్తీకరించబడిన జన్యువుల తరగతిని సూచిస్తుంది మరియు కణాల ప్రాథమిక జీవిత కార్యకలాపాలను నిర్వహించడానికి వాటి ఉత్పత్తులు అవసరం.
ఈ భావనను గందరగోళానికి గురి చేయవద్దు.గృహనిర్వాహక జన్యువులు జీవసంబంధమైన విధి పదాలు, అంతర్గత సూచన జన్యువులు ప్రయోగాత్మక సాంకేతిక పదాలు.గృహనిర్వాహక జన్యువులను అంతర్గత సూచన జన్యువులుగా ఎంచుకోవడానికి ముందు ధ్రువీకరణను పాస్ చేయాలి.
ఉదాహరణకు, మేము వివిధ కణజాల కణాలలో వాటి వ్యక్తీకరణ స్థాయిలను పరీక్షించడానికి దిగువ చిత్రంలో అనేక గృహనిర్వాహక జన్యువులను ఎంచుకున్నాము మరియు β-2-మైక్రోగ్లోబులిన్ యొక్క వ్యక్తీకరణ స్థాయిలు ఇతర మూడు జన్యువుల కంటే చాలా భిన్నంగా ఉన్నాయని కనుగొన్నాము, కాబట్టి వాటిని అంతర్గత సూచన జన్యువులుగా ఉపయోగించలేము.

అంతర్గత సూచన జన్యువు యొక్క దిద్దుబాటు పనితీరును అర్థం చేసుకున్న తర్వాత, అంతర్గత సూచన జన్యువు యొక్క పరిచయం కారణంగా రెండు అల్గారిథమ్‌లు ఉత్పన్నమవుతాయి.
· డబుల్ స్టాండర్డ్ కర్వ్ పద్ధతి
·2 – △△Ct పద్ధతి (CT విలువ పోలిక పద్ధతి)
మీరు జాతులు మరియు జన్యు విధులను అధ్యయనం చేయడానికి ఆసక్తి కలిగి ఉంటే, దయచేసి అల్గారిథమ్‌లపై పరిశోధనను వదులుకోండి మరియు సూత్రాలను నేరుగా ఉపయోగించండి లేదా యంత్రాలను నేరుగా ఉపయోగించండి;మీరు గణితం మరియు ఇంజనీరింగ్‌లో సరళ వ్యక్తి అయితే, దయచేసి సంకోచించకండి.
డబుల్ స్టాండర్డ్ కర్వ్ పద్ధతి
నియంత్రణ నమూనా యొక్క లక్ష్య జన్యువు మరియు గృహనిర్వాహక జన్యువును మరియు ప్రామాణిక వక్రరేఖ ద్వారా పరీక్షించాల్సిన నమూనాను లెక్కించండి, ఆపై సాపేక్ష వ్యక్తీకరణ స్థాయి అయిన గణన సూత్రం ప్రకారం సాపేక్ష విలువను లెక్కించండి.
ప్రయోజనాలు: సాధారణ విశ్లేషణ, సాపేక్షంగా సాధారణ ప్రయోగాత్మక ఆప్టిమైజేషన్
ప్రతికూలత: ప్రతి జన్యువు కోసం, ప్రతి రౌండ్ ప్రయోగాలు తప్పనిసరిగా ప్రామాణిక వక్రతను తయారు చేయాలి
అప్లికేషన్: జన్యు వ్యక్తీకరణ నియంత్రణ అధ్యయనంలో సాధారణంగా ఉపయోగించే మరియు గుర్తించబడిన సాపేక్ష పరిమాణాత్మక పద్ధతుల్లో ఒకటి
సూత్రం క్రింది విధంగా ఉంది:

ఉదాహరణలు క్రింది విధంగా ఉన్నాయి:

పరిమాణాత్మక ఫలితం ఆధారంగా సంబంధిత మొత్తాన్ని లెక్కించండి
2 – △△Ct పద్ధతి (CT విలువ పోలిక పద్ధతి)

ప్రయోజనాలు: ప్రామాణిక వక్రతను తయారు చేయవలసిన అవసరం లేదు
ప్రతికూలతలు: యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం 100%కి దగ్గరగా ఉంటుందని భావించబడుతుంది;ప్రామాణిక విచలనం <5%, మరియు ప్రతి యాంప్లిఫికేషన్ మధ్య ప్రామాణిక వక్రత మరియు సామర్థ్యం స్థిరంగా ఉన్నట్లు భావించబడుతుంది;ప్రయోగాత్మక పరిస్థితుల ఆప్టిమైజేషన్ మరింత క్లిష్టంగా ఉంటుంది.
అప్లికేషన్: జన్యు వ్యక్తీకరణ నియంత్రణ అధ్యయనంలో సాధారణంగా ఉపయోగించే మరియు గుర్తించబడిన సాపేక్ష పరిమాణాత్మక పద్ధతుల్లో ఒకటి

వాస్తవానికి, యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం ఖచ్చితంగా ఉండటం అసాధ్యం 1. దిద్దుబాటు పద్ధతి: లక్ష్య జన్యువు మరియు రిఫరెన్స్ జన్యువు ఒకే విధమైన విస్తరణ సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉన్నాయని మనకు తెలిస్తే, కానీ యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం 1కి సమానంగా ఉండదు, అప్పుడు 2－△△Ctని ఇలా సరిచేయవచ్చు: (1+E ) గణన సూత్రాన్ని 1.95△△Ctకి సరిచేయవచ్చు
ఇప్పటివరకు, ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR గురించిన కంటెంట్ ముగింపుకు వచ్చింది .