రియల్ టైమ్ PCR ప్రైమర్ డిజైన్ సూత్రాలు

ఫార్వర్డ్ ప్రైమర్ మరియు రివర్స్ ప్రైమర్

రియల్ టైమ్ PCR కోసం, ప్రైమర్ డిజైన్ చాలా ముఖ్యం.ప్రైమర్‌లు PCR యాంప్లిఫికేషన్ యొక్క విశిష్టత మరియు సామర్థ్యానికి సంబంధించినవి మరియు క్రింది సూత్రాలకు సంబంధించి రూపొందించబడతాయి:

ప్రైమర్ పొడవు: 18-30bp.

GC కంటెంట్: 40-60%.

Tm విలువ: ప్రైమర్ 5 వంటి ప్రైమర్ డిజైన్ సాఫ్ట్‌వేర్, ప్రైమర్ యొక్క Tm విలువను ఇవ్వగలదు.అప్‌స్ట్రీమ్ మరియు డౌన్‌స్ట్రీమ్ ప్రైమర్‌ల Tm విలువలు వీలైనంత దగ్గరగా ఉండాలి.Tm గణన సూత్రాన్ని కూడా ఉపయోగించవచ్చు: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).PCR చేస్తున్నప్పుడు, ప్రైమర్ Tm విలువ 5 °C కంటే తక్కువ ఉష్ణోగ్రత సాధారణంగా ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతగా ఎంపిక చేయబడుతుంది (ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతలో సంబంధిత పెరుగుదల PCR ప్రతిచర్య యొక్క నిర్దిష్టతను పెంచుతుంది).

ప్రైమర్‌లు మరియు PCR ఉత్పత్తులు:

డిజైన్ ప్రైమర్ PCR యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తి పొడవు ప్రాధాన్యంగా 100-150bp.

టెంప్లేట్ యొక్క సెకండరీ స్ట్రక్చరల్ ఏరియాలో డిజైన్ ప్రైమర్‌లను వీలైనంత వరకు నివారించాలి.

అప్‌స్ట్రీమ్ మరియు డౌన్‌స్ట్రీమ్ ప్రైమర్‌ల 3′ చివరల మధ్య 2 లేదా అంతకంటే ఎక్కువ కాంప్లిమెంటరీ బేస్‌ల ఏర్పాటును నివారించండి.

ప్రైమర్ 3′ టెర్మినల్ బేస్ 3 అదనపు వరుస G లేదా Cతో ఉండకూడదు.

ప్రైమర్లు తాము పరిపూరకరమైన నిర్మాణాలను కలిగి ఉండవు, లేకుంటే ఒక హెయిర్‌పిన్ నిర్మాణం ఏర్పడుతుంది, ఇది PCR విస్తరణను ప్రభావితం చేస్తుంది.

ATCGని ప్రైమర్ సీక్వెన్స్‌లో వీలైనంత సమానంగా పంపిణీ చేయాలి మరియు 3′ టెర్మినల్ బేస్‌ను T వలె నివారించాలి.

అనుబంధం 1: సెల్ డైరెక్ట్ RT-qPCR కిట్ కాంపోనెంట్ సప్లిమెంట్ ప్యాక్

1.సెల్ లిసిస్ సొల్యూషన్