యాంప్లిఫికేషన్ సిగ్నల్స్ లేవు

1.కిట్‌లోని Taq DNA పాలిమరేస్ సరైన నిల్వ లేదా కిట్ గడువు ముగియడం వల్ల దాని కార్యాచరణను కోల్పోతుంది.
సిఫార్సు: కిట్ యొక్క నిల్వ పరిస్థితులను నిర్ధారించండి;PCR సిస్టమ్‌కు తగిన మొత్తంలో Taq DNA పాలిమరేస్‌ని మళ్లీ జోడించండి లేదా సంబంధిత ప్రయోగాల కోసం కొత్త రియల్ టైమ్ PCR కిట్‌ని కొనుగోలు చేయండి.

2.DNA టెంప్లేట్‌లో టాక్ DNA పాలిమరేస్ యొక్క నిరోధకాలు చాలా ఉన్నాయి.
సూచన: టెంప్లేట్‌ను మళ్లీ శుద్ధి చేయండి లేదా ఉపయోగించిన టెంప్లేట్ మొత్తాన్ని తగ్గించండి.

3.Mg2+ ఏకాగ్రత తగినది కాదు.
సిఫార్సు: మేము అందించే 2× రియల్ PCR మిక్స్ యొక్క Mg2+ గాఢత 3.5mM.అయితే, కొన్ని ప్రత్యేక ప్రైమర్‌లు మరియు టెంప్లేట్‌ల కోసం, Mg2+ ఏకాగ్రత ఎక్కువగా ఉండవచ్చు.కాబట్టి, మీరు Mg2+ ఏకాగ్రతను ఆప్టిమైజ్ చేయడానికి నేరుగా MgCl2ని జోడించవచ్చు.ఆప్టిమైజేషన్ కోసం ప్రతిసారీ Mg2+ 0.5mMని పెంచాలని సిఫార్సు చేయబడింది.

4.PCR యాంప్లిఫికేషన్ పరిస్థితులు అనుకూలంగా లేవు మరియు ప్రైమర్ సీక్వెన్స్ లేదా ఏకాగ్రత సరికాదు.
సూచన: ప్రైమర్ సీక్వెన్స్ యొక్క ఖచ్చితత్వాన్ని నిర్ధారించండి మరియు ప్రైమర్ అధోకరణం చెందలేదు;యాంప్లిఫికేషన్ సిగ్నల్ బాగా లేకుంటే, ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను తగ్గించడానికి ప్రయత్నించండి మరియు ప్రైమర్ ఏకాగ్రతను తగిన విధంగా సర్దుబాటు చేయండి.

5.టెంప్లేట్ మొత్తం చాలా తక్కువ లేదా చాలా ఎక్కువ.
సిఫార్సు: టెంప్లేట్ లీనియరైజేషన్ గ్రేడియంట్ డైల్యూషన్‌ను అమలు చేయండి మరియు రియల్ టైమ్ PCR ప్రయోగం కోసం ఉత్తమ PCR ప్రభావంతో టెంప్లేట్ ఏకాగ్రతను ఎంచుకోండి.

NTC చాలా ఎక్కువ ఫ్లోరోసెన్స్ విలువను కలిగి ఉంది

1.ఆపరేషన్ సమయంలో సంభవించే రియాజెంట్ కాలుష్యం.
సిఫార్సు: రియల్ టైమ్ PCR ప్రయోగాల కోసం కొత్త రియాజెంట్‌లతో భర్తీ చేయండి.

2. PCR ప్రతిచర్య వ్యవస్థ తయారీ సమయంలో కాలుష్యం సంభవించింది.
సిఫార్సు: ఆపరేషన్ సమయంలో అవసరమైన రక్షణ చర్యలు తీసుకోండి, అవి: రబ్బరు తొడుగులు ధరించడం, ఫిల్టర్‌తో పైపెట్ చిట్కాను ఉపయోగించడం మొదలైనవి.

3. ప్రైమర్‌లు అధోకరణం చెందాయి మరియు ప్రైమర్‌ల క్షీణత నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్‌కు కారణమవుతుంది.
సూచన: ప్రైమర్‌లు అధోకరణం చెందాయో లేదో గుర్తించడానికి SDS-PAGE ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్‌ని ఉపయోగించండి మరియు వాటిని రియల్ టైమ్ PCR ప్రయోగాల కోసం కొత్త ప్రైమర్‌లతో భర్తీ చేయండి.

ప్రైమర్ డైమర్ లేదా నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్

1.Mg2+ ఏకాగ్రత తగినది కాదు.
సిఫార్సు: మేము అందించే 2× రియల్ PCR ఈజీ TM మిక్స్ యొక్క Mg2+ గాఢత 3.5 mM.అయితే, కొన్ని ప్రత్యేక ప్రైమర్‌లు మరియు టెంప్లేట్‌ల కోసం, Mg2+ ఏకాగ్రత ఎక్కువగా ఉండవచ్చు.కాబట్టి, మీరు Mg2+ ఏకాగ్రతను ఆప్టిమైజ్ చేయడానికి నేరుగా MgCl2ని జోడించవచ్చు.ఆప్టిమైజేషన్ కోసం ప్రతిసారీ Mg2+ 0.5mMని పెంచాలని సిఫార్సు చేయబడింది.

2.PCR ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత చాలా తక్కువగా ఉంది.
సూచన: ప్రతిసారీ PCR ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను 1℃ లేదా 2℃ పెంచండి.

3.PCR ఉత్పత్తి చాలా పొడవుగా ఉంది.
సిఫార్సు: రియల్ టైమ్ PCR ఉత్పత్తి యొక్క పొడవు 100-150bp మధ్య ఉండాలి, 500bp కంటే ఎక్కువ ఉండకూడదు.

4. ప్రైమర్‌లు అధోకరణం చెందాయి మరియు ప్రైమర్‌ల క్షీణత నిర్దిష్ట విస్తరణ రూపానికి దారి తీస్తుంది.
సూచన: ప్రైమర్‌లు అధోకరణం చెందాయో లేదో గుర్తించడానికి SDS-PAGE ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్‌ని ఉపయోగించండి మరియు వాటిని రియల్ టైమ్ PCR ప్రయోగాల కోసం కొత్త ప్రైమర్‌లతో భర్తీ చేయండి.

5.PCR వ్యవస్థ సరికాదు లేదా సిస్టమ్ చాలా చిన్నది.
సూచన: PCR రియాక్షన్ సిస్టమ్ చాలా చిన్నది కనుక గుర్తింపు ఖచ్చితత్వం తగ్గుతుంది.రియల్ టైమ్ PCR ప్రయోగాన్ని మళ్లీ అమలు చేయడానికి క్వాంటిటేటివ్ PCR పరికరం ద్వారా సిఫార్సు చేయబడిన ప్రతిచర్య వ్యవస్థను ఉపయోగించడం ఉత్తమం.

పరిమాణాత్మక విలువల యొక్క పేలవమైన పునరావృతత

1.పరికరం తప్పుగా పని చేస్తోంది.
సూచన: పరికరం యొక్క ప్రతి PCR రంధ్రం మధ్య లోపాలు ఉండవచ్చు, ఫలితంగా ఉష్ణోగ్రత నిర్వహణ లేదా గుర్తింపు సమయంలో పేలవమైన పునరుత్పత్తి ఉంటుంది.దయచేసి సంబంధిత పరికరం యొక్క సూచనల ప్రకారం తనిఖీ చేయండి.

2.నమూనా స్వచ్ఛత మంచిది కాదు.
సిఫార్సు: అశుద్ధ నమూనాలు టెంప్లేట్ మరియు ప్రైమర్‌ల స్వచ్ఛతను కలిగి ఉన్న ప్రయోగం యొక్క పేలవమైన పునరుత్పత్తికి దారి తీస్తుంది.టెంప్లేట్‌ను మళ్లీ శుద్ధి చేయడం ఉత్తమం మరియు ప్రైమర్‌లు SDS-PAGE ద్వారా ఉత్తమంగా శుద్ధి చేయబడతాయి.

3.PCR సిస్టమ్ తయారీ మరియు నిల్వ సమయం చాలా ఎక్కువ.
సూచన: తయారు చేసిన వెంటనే PCR ప్రయోగం కోసం రియల్ టైమ్ PCR సిస్టమ్‌ను ఉపయోగించండి మరియు దానిని ఎక్కువసేపు పక్కన పెట్టవద్దు.

4.PCR యాంప్లిఫికేషన్ పరిస్థితులు అనుకూలంగా లేవు మరియు ప్రైమర్ సీక్వెన్స్ లేదా ఏకాగ్రత సరికాదు.
సూచన: ప్రైమర్ సీక్వెన్స్ యొక్క ఖచ్చితత్వాన్ని నిర్ధారించండి మరియు ప్రైమర్ అధోకరణం చెందలేదు;యాంప్లిఫికేషన్ సిగ్నల్ బాగా లేకుంటే, ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను తగ్గించడానికి ప్రయత్నించండి మరియు ప్రైమర్ ఏకాగ్రతను తగిన విధంగా సర్దుబాటు చేయండి.

5.PCR వ్యవస్థ సరికాదు లేదా సిస్టమ్ చాలా చిన్నది.
సూచన: PCR రియాక్షన్ సిస్టమ్ చాలా చిన్నది కనుక గుర్తింపు ఖచ్చితత్వం తగ్గుతుంది.రియల్ టైమ్ PCR ప్రయోగాన్ని మళ్లీ అమలు చేయడానికి క్వాంటిటేటివ్ PCR పరికరం ద్వారా సిఫార్సు చేయబడిన ప్రతిచర్య వ్యవస్థను ఉపయోగించడం ఉత్తమం.