కేంద్ర సిద్ధాంతంలో, RNA అనేది DNA మరియు ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణల మధ్య ట్రాన్స్‌క్రిప్షనల్ మధ్యవర్తి అని అందరికీ తెలుసు.DNA గుర్తింపుతో పోలిస్తే, RNA యొక్క గుర్తింపు జీవులలో జన్యు వ్యక్తీకరణను మరింత నిష్పాక్షికంగా ప్రతిబింబిస్తుంది.RNAతో కూడిన ప్రయోగాలు: qRT-PCR, RNA-Seq, మరియు ఫ్యూజన్ జీన్ డిటెక్షన్ మొదలైనవి. RNA యొక్క లక్షణాల ఆధారంగా (RNA యొక్క చక్కెర వలయం DNA యొక్క చక్కెర వలయం కంటే ఒక ఉచిత హైడ్రాక్సిల్ సమూహాన్ని కలిగి ఉంటుంది), పర్యావరణంలో పెద్ద సంఖ్యలో RNaseలతో కలిపి, RNA DNA కంటే అస్థిరంగా ఉంటుంది మరియు అధోకరణం చెందడం సులభం.ఆర్‌ఎన్‌ఏ నాణ్యత బాగా లేకుంటే చెత్తను, చెత్తను బయటకు తీయండి, అప్పుడు ప్రయోగాత్మక ఫలితాలు సంతృప్తికరంగా ఉండాలి, ప్రత్యేకంగా సరికాని డేటా లేదా పేలవమైన రిపీటబిలిటీగా వ్యక్తమవుతాయి.అందువల్ల, RNA యొక్క ప్రాసెసింగ్‌పై ఎక్కువ శ్రద్ధ ఉండాలి మరియు తదుపరి ప్రయోగాత్మక డేటా యొక్క ఖచ్చితత్వం మరియు ఖచ్చితత్వాన్ని నిర్ధారించడానికి నాణ్యత నియంత్రణ యొక్క లింక్ కూడా చాలా ముఖ్యమైనది.

RNA యొక్క నాణ్యత నియంత్రణ కోసం, సాధారణంగా క్రింది సాధారణంగా ఉపయోగించే పద్ధతులు ఉన్నాయి:

• స్పెక్ట్రోఫోటోమెట్రీ
• అగరోజ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్
• ఎజిలెంట్ బయోఅనలైజర్
• నిజ-సమయ ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR
• క్యూబిట్ ఫ్లోరోసెంట్ డై పద్ధతి

01 స్పెక్ట్రోఫోటోమెట్రీ

RNA ద్వంద్వ బంధాలను సంయోగం చేసింది మరియు 260nm తరంగదైర్ఘ్యం వద్ద శోషణ శిఖరాన్ని కలిగి ఉంటుంది.లాంబెర్ట్-బీర్ యొక్క చట్టం ప్రకారం, మేము 260nm వద్ద శోషణ శిఖరం నుండి RNA గాఢతను లెక్కించవచ్చు.అదనంగా, మేము 260nm, 280nm మరియు 230nm శోషణ శిఖరాల నిష్పత్తి ప్రకారం RNA యొక్క స్వచ్ఛతను కూడా లెక్కించవచ్చు.280nm మరియు 230nm వరుసగా ప్రోటీన్లు మరియు చిన్న అణువుల శోషణ శిఖరాలు.అర్హత కలిగిన RNA స్వచ్ఛత యొక్క A260/A280 మరియు A260/A230 నిష్పత్తి 2 కంటే ఎక్కువగా ఉండాలి. అది 2 కంటే తక్కువగా ఉంటే, RNA నమూనాలో ప్రోటీన్ లేదా చిన్న అణువుల కాలుష్యం ఉందని మరియు మళ్లీ శుద్ధి చేయబడాలని అర్థం.కాలుష్య మూలాలు, PCR ప్రతిచర్యల యొక్క విస్తరణ సామర్థ్యాన్ని నిరోధించడం వంటి దిగువ ప్రయోగాలను ప్రభావితం చేస్తాయి, ఫలితంగా సరికాని పరిమాణాత్మక ఫలితాలు వస్తాయి.RNA యొక్క స్వచ్ఛత తదుపరి ఫలితాలపై గొప్ప ప్రభావాన్ని చూపుతుంది, కాబట్టి స్పెక్ట్రోఫోటోమెట్రీ సాధారణంగా న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ ప్రయోగాలలో మొదటి దశలో ఒక అనివార్యమైన నాణ్యత నియంత్రణ లింక్.

మూర్తి 1. సాధారణ RNA/DNA శోషణ స్పెక్ట్రమ్

02 అగరోస్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్

స్వచ్ఛతతో పాటు, RNA యొక్క సమగ్రత కూడా RNA నాణ్యతను నిర్ధారించడానికి ముఖ్యమైన సూచికలలో ఒకటి.RNA యొక్క క్షీణత నమూనాలో పెద్ద సంఖ్యలో చిన్న శకలాలకు దారి తీస్తుంది, కాబట్టి ప్రభావవంతంగా గుర్తించబడే మరియు సూచన క్రమం ద్వారా కవర్ చేయగల RNA శకలాలు తగ్గించబడతాయి.1% అగరోజ్ జెల్‌పై మొత్తం RNA యొక్క ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా RNA సమగ్రతను తనిఖీ చేయవచ్చు.ఈ పద్ధతి జెల్‌ను మీరే కాన్ఫిగర్ చేయవచ్చు లేదా సమగ్రత పరీక్ష కోసం ముందుగా నిర్మించిన E-Gel™ సిస్టమ్‌ని ఉపయోగించవచ్చు.మొత్తం RNAలో 80% కంటే ఎక్కువ రైబోసోమల్ RNA ఉంది, వీటిలో ఎక్కువ భాగం 28S మరియు 18S rRNA (క్షీరద వ్యవస్థలలో)తో కూడి ఉంటుంది.మంచి నాణ్యత గల RNA రెండు స్పష్టమైన ప్రకాశవంతమైన బార్‌లను చూపుతుంది, అవి వరుసగా 5 Kb మరియు 2 Kb వద్ద 28S మరియు 18S ప్రకాశవంతమైన బార్‌లను చూపుతాయి మరియు నిష్పత్తి 2:1కి దగ్గరగా ఉంటుంది.అది విస్తరించిన స్థితిలో ఉన్నట్లయితే, RNA నమూనా అధోకరణం చెంది ఉండవచ్చు మరియు RNA నాణ్యతను మరింత పరీక్షించడానికి తర్వాత వివరించిన పద్ధతిని ఉపయోగించమని సిఫార్సు చేయబడింది.

మూర్తి 2. అగరోజ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్‌పై క్షీణించిన (లేన్ 2) మరియు చెక్కుచెదరకుండా ఉన్న RNA (లేన్ 3) పోలిక

03 ఎజిలెంట్ బయోఅనలైజర్

పైన వివరించిన అగరోస్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ పద్ధతికి అదనంగా, RNA యొక్క సమగ్రతను సులభంగా మరియు త్వరగా గుర్తించడంలో మాకు సహాయపడుతుంది, మేము RNA యొక్క సమగ్రతను గుర్తించడానికి ఎజిలెంట్ బయోఅనలైజర్‌ను కూడా ఉపయోగించవచ్చు.ఇది RNA ఏకాగ్రత మరియు సమగ్రతను అంచనా వేయడానికి మైక్రోఫ్లూయిడిక్స్, క్యాపిల్లరీ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ మరియు ఫ్లోరోసెన్స్ కలయికను ఉపయోగిస్తుంది.RNA నమూనా యొక్క ప్రొఫైల్‌ను విశ్లేషించడానికి అంతర్నిర్మిత అల్గారిథమ్‌ని ఉపయోగించడం ద్వారా, ఎజిలెంట్ బయోఅనలైజర్ సూచన RNA సమగ్రత విలువ, RNA సమగ్రత సంఖ్య (ఇకపై RINగా సూచిస్తారు) [1]ను లెక్కించవచ్చు.RIN యొక్క పెద్ద విలువ, RNA యొక్క సమగ్రత ఎక్కువగా ఉంటుంది (1 చాలా క్షీణించింది, 10 చాలా పూర్తి అవుతుంది).RNAతో కూడిన కొన్ని ప్రయోగాలు నాణ్యత అంచనా కోసం RINని పారామీటర్‌గా ఉపయోగించాలని సూచిస్తున్నాయి.హై-త్రూపుట్ సీక్వెన్సింగ్ ప్రయోగాలను (ఇకపై NGSగా సూచిస్తారు) ఉదాహరణగా తీసుకుంటే, థర్మో ఫిషర్ యొక్క ఆన్‌కోమైన్ ప్యానెల్ సిరీస్‌లోని B సెల్ మరియు T సెల్ యాంటిజెన్ రిసెప్టర్‌లను గుర్తించడానికి ఉపయోగించే Oncomine™ హ్యూమన్ ఇమ్యూన్ రిపర్టోయిర్ యొక్క మార్గదర్శకాలు, RIN విలువలతో కూడిన నమూనాలు 4 కంటే ఎక్కువ ప్రభావవంతంగా ఉండవచ్చని సూచిస్తున్నాయి.విభిన్న ప్యానెల్‌ల కోసం విభిన్న సిఫార్సు పరిధులు ఉన్నాయి మరియు తరచుగా అధిక RIN మరింత ప్రభావవంతమైన డేటాను తీసుకురాగలదు.

మూర్తి 3, Oncomine™ హ్యూమన్ ఇమ్యూన్ రిపర్టోయిర్ ప్రయోగాలలో, RIN 4 కంటే ఎక్కువ ఉన్న నమూనాలు మరింత ప్రభావవంతమైన రీడ్‌లు మరియు T సెల్ క్లోన్‌లను గుర్తించగలవు.【2】

అయితే, RIN విలువకు కూడా కొన్ని పరిమితులు ఉన్నాయి.NGS ప్రయోగాత్మక డేటా నాణ్యతతో RINకి అధిక సహసంబంధం ఉన్నప్పటికీ, ఇది FFPE నమూనాలకు తగినది కాదు.FFPE నమూనాలు చాలా కాలం పాటు రసాయనికంగా చికిత్స చేయబడ్డాయి మరియు సేకరించిన RNA సాధారణంగా సాపేక్షంగా తక్కువ RIN విలువను కలిగి ఉంటుంది.అయినప్పటికీ, ప్రయోగం యొక్క ప్రభావవంతమైన డేటా సంతృప్తికరంగా లేదని దీని అర్థం కాదు.FFPE నమూనాల నాణ్యతను ఖచ్చితంగా అంచనా వేయడానికి, మేము RIN కాకుండా ఇతర కొలతలను ఉపయోగించాలి.RINతో పాటు, ఎజిలెంట్ బయోఅనలైజర్ కూడా DV200 విలువను RNA నాణ్యత యొక్క మూల్యాంకన పరామితిగా లెక్కించగలదు.DV200 అనేది RNA నమూనాలో 200 bp కంటే పెద్ద శకలాల నిష్పత్తిని గణించే పరామితి.DV200 అనేది RIN కంటే FFPE నమూనా నాణ్యతకు మెరుగైన సూచిక.FFPE ద్వారా సంగ్రహించబడిన RNA కొరకు, ఇది సమర్థవంతంగా గుర్తించగలిగే జన్యువుల సంఖ్య మరియు జన్యువుల వైవిధ్యంతో చాలా ఎక్కువ సహసంబంధాన్ని కలిగి ఉంది [3].DV200 FFPE యొక్క నాణ్యతను గుర్తించడంలో లోపాలను భర్తీ చేయగలిగినప్పటికీ, ఎజిలెంట్ బయోఅనలైజర్ ఇప్పటికీ RNA నమూనాలలో నాణ్యత సమస్యలను సమగ్రంగా విశ్లేషించలేదు, నమూనాలలో నిరోధకాలు ఉన్నాయా లేదా అనే దానితో సహా.నిరోధకాలు దిగువ ప్రయోగాల విస్తరణ సామర్థ్యాన్ని ప్రభావితం చేస్తాయి మరియు ఉపయోగకరమైన డేటా మొత్తాన్ని తగ్గిస్తాయి.నమూనాలో నిరోధకం ఉందో లేదో తెలుసుకోవడానికి, మేము తదుపరి వివరించిన నిజ-సమయ ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR పద్ధతిని అనుసరించవచ్చు.

04 నిజ-సమయ ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR

నిజ-సమయ ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR పద్ధతి నమూనాలోని నిరోధకాలను గుర్తించడమే కాకుండా, FFPE నమూనాలోని RNA నాణ్యతను ఖచ్చితంగా ప్రతిబింబిస్తుంది.ఎజిలెంట్ బయోలాజికల్ ఎనలైజర్‌లతో పోలిస్తే, రియల్-టైమ్ ఫ్లోరోసెన్స్ క్వాంటిటేటివ్ సాధనాలు వాటి విస్తృత అప్లికేషన్ కారణంగా ప్రధాన జీవశాస్త్ర ప్రయోగశాలలలో బాగా ప్రాచుర్యం పొందాయి.RNA నమూనాల నాణ్యతను పరీక్షించడానికి, మేము GUSB (Cat no. Hs00939627) వంటి అంతర్గత సూచన జన్యువుల కోసం ప్రైమర్ ప్రోబ్‌లను మాత్రమే కొనుగోలు చేయాలి లేదా సిద్ధం చేయాలి.సంపూర్ణ పరిమాణాత్మక ప్రయోగాలను నిర్వహించడానికి ఈ ప్రైమర్‌లు, ప్రోబ్‌లు మరియు ప్రమాణాల (తెలిసిన ఏకాగ్రత యొక్క మొత్తం RNA) సెట్‌ను ఉపయోగించడం ద్వారా, ప్రభావవంతమైన RNA ఫ్రాగ్మెంట్ ఏకాగ్రతను RNA నాణ్యత యొక్క మూల్యాంకన ప్రమాణంగా లెక్కించవచ్చు (క్లుప్తంగా ఫంక్షనల్ RNA క్వాంటిటేషన్ (FRQ)).NGS పరీక్షలో, RNA నమూనాల FRQ ప్రభావవంతమైన డేటా వాల్యూమ్‌తో చాలా ఎక్కువ సహసంబంధాన్ని కలిగి ఉందని మేము కనుగొన్నాము.0.2ng/uL FRQ కంటే ఎక్కువ ఉన్న అన్ని నమూనాల కోసం, కనీసం 70% రీడ్‌లు సూచన క్రమాన్ని సమర్థవంతంగా కవర్ చేయగలవు (మూర్తి 4).

మూర్తి 4, ఫ్లోరోసెన్స్ క్వాంటిటేటివ్ పద్ధతి ద్వారా కనుగొనబడిన FRQ విలువ NGS ప్రయోగంలో పొందిన ప్రభావవంతమైన డేటాతో చాలా ఎక్కువ సహసంబంధాన్ని (R2> 0.9) కలిగి ఉంది.ఎరుపు గీత FRQ విలువ 0.2 ng/uL (log10 = -0.7)కి సమానం.【4】

FFPE నమూనాలకు వర్తింపజేయడంతో పాటు, నిజ-సమయ పరిమాణాత్మక PCR పద్ధతి కూడా నమూనాలలో నిరోధకాలను సమర్థవంతంగా పర్యవేక్షించగలదు.మేము అంతర్గత సానుకూల నియంత్రణ (IPC) మరియు దాని విశ్లేషణతో ప్రతిచర్య సిస్టమ్‌లో గుర్తించబడే నమూనాను జోడించవచ్చు, ఆపై Ct విలువను పొందేందుకు ఫ్లోరోసెన్స్ పరిమాణాన్ని నిర్వహించవచ్చు.నో-నమూనా ప్రతిచర్యలో Ct విలువ Ct విలువ కంటే వెనుకబడి ఉంటే, ఇది నమూనాలో నిరోధకం ఉందని సూచిస్తుంది మరియు ప్రతిచర్యలో యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని నిరోధిస్తుంది.

05 Qubit ఫ్లోరోసెంట్ డై పద్ధతి

క్యూబిట్ ఫ్లోరోమీటర్ అనేది న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ ఏకాగ్రత మరియు స్వచ్ఛతను గుర్తించడం కోసం సాధారణంగా ఉపయోగించే చిన్న పరికరం, ఇది ఆపరేట్ చేయడం సులభం మరియు దాదాపు ప్రతి పరమాణు జీవశాస్త్ర ప్రయోగశాలలో ఉంది.ఇది న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ యొక్క సాంద్రతను గుర్తించడం మరియు న్యూక్లియిక్ యాసిడ్-బైండింగ్ ఫ్లోరోసెంట్ డై (క్విట్ డిటెక్షన్ రియాజెంట్) ద్వారా ఖచ్చితంగా గణిస్తుంది.Qubit అధిక సున్నితత్వం మరియు విశిష్టతను కలిగి ఉంది మరియు pg/µL గాఢత వరకు RNAను ఖచ్చితంగా లెక్కించగలదు.న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ ఏకాగ్రతను ఖచ్చితంగా లెక్కించే ప్రసిద్ధ సామర్థ్యంతో పాటు, థర్మో ఫిషర్ యొక్క తాజా కొత్త మోడల్, క్యూబిట్ 4.0, RNA యొక్క సమగ్రతను కూడా గుర్తించగలదు.Qubit 4.0′s RNA డిటెక్షన్ సిస్టమ్ (RNA IQ అస్సే) రెండు నిర్దిష్ట ఫ్లోరోసెంట్ రంగులను ఏకకాలంలో గుర్తించడం ద్వారా RNA యొక్క సమగ్రతను గుర్తిస్తుంది.ఈ రెండు ఫ్లోరోసెంట్ రంగులు వరుసగా RNA యొక్క పెద్ద శకలాలు మరియు చిన్న శకలాలు బంధించగలవు.ఈ రెండు ఫ్లోరోసెంట్ రంగులు నమూనాలో RNA యొక్క పెద్ద శకలాల నిష్పత్తిని సూచిస్తాయి మరియు దీని నుండి RNA నాణ్యతను సూచించే IQ (ఇంటిగ్రిటీ మరియు క్వాలిటీ) విలువను లెక్కించవచ్చు.IQ విలువ FFPE మరియు FFPEయేతర నమూనాల రెండింటికీ వర్తిస్తుంది మరియు తదుపరి సీక్వెన్సింగ్ నాణ్యతపై గొప్ప ప్రభావాన్ని చూపుతుంది.NGS ప్రయోగాలను ఉదాహరణగా తీసుకుంటే, అయాన్ టొరెంట్™ ప్లాట్‌ఫారమ్‌పై ప్రదర్శించిన RNA-Seq పరీక్ష ప్రయోగాలలో, 4 కంటే ఎక్కువ IQ విలువలు కలిగిన చాలా నమూనాలు కనీసం 50% ప్రభావవంతమైన రీడ్‌లను కలిగి ఉన్నాయి (మూర్తి 5).పైన పేర్కొన్న గుర్తింపు పద్ధతులతో పోలిస్తే, Qubit IQ అస్సే ఆపరేట్ చేయడానికి మరింత సౌకర్యవంతంగా ఉంటుంది మరియు తక్కువ సమయం తీసుకుంటుంది (ఐదు నిమిషాలలోపు), కానీ కొలిచిన పరామితి IQ విలువ మరియు దిగువ ప్రయోగాల డేటా నాణ్యత మధ్య గొప్ప సహసంబంధాన్ని కలిగి ఉంటుంది.

మూర్తి 5, Qubit RNA IQ విలువ మరియు RNA-Seq యొక్క మ్యాప్ చేసిన రీడ్‌ల మధ్య గొప్ప సహసంబంధం ఉంది.【5】

పై పరిచయం ద్వారా, ప్రతి ఒక్కరికి వివిధ RNA నాణ్యత నియంత్రణ పద్ధతులపై తగినంత అవగాహన ఉందని నేను నమ్ముతున్నాను.ఆచరణలో, మీరు ఎంచుకోవచ్చునమూనా రకం మరియు ఇప్పటికే ఉన్న సాధనాల ప్రకారం సంబంధిత పద్ధతి.RNA నాణ్యతను బాగా నియంత్రించడం ద్వారా మాత్రమే మేము పేలవమైన నమూనా నాణ్యత వల్ల కలిగే తదుపరి ప్రయోగాల వైఫల్యాన్ని నివారించగలము, తద్వారా విలువైన సమయం, శక్తి మరియు ఖర్చు ఆదా అవుతుంది.

సూచన ఉత్పత్తులు:

యానిమల్ టోటల్ RNA ఐసోలేషన్ కిట్

సెల్ మొత్తం RNA ఐసోలేషన్ కిట్

ప్రస్తావనలు

【1】ష్రోడర్, A., ముల్లెర్, O., స్టాకర్, S. మరియు ఇతరులు.RIN: RNA కొలతలకు సమగ్రత విలువలను కేటాయించడానికి ఒక RNA సమగ్రత సంఖ్య.BMC మాలిక్యులర్ బయోల్ 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】ఆన్‌కమైన్ హ్యూమన్ ఇమ్యూన్ రిపర్టోయిర్ యూజర్ గైడ్ (పబ్. నం. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】లీహ్ సి వెహ్మాస్, చార్లెస్ ఇ వుడ్, బ్రియాన్ ఎన్ చోర్లీ, కరోల్ ఎల్ యౌక్, గెయిల్ ఎమ్ నెల్సన్, సుసాన్ డి హెస్టర్, ఆర్‌ఎన్‌ఏను అంచనా వేయడానికి మెరుగైన నాణ్యతా ప్రమాణాలు వయస్సు 357–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/