మేము అనుభవజ్ఞులైన తయారీదారుని కలిగి ఉన్నాము.బిగ్ డిస్కౌంట్ చైనా హై సెన్సిటివిటీ వన్-స్టెప్ ప్రోబ్ Rt- కోసం దాని మార్కెట్ యొక్క కీలకమైన ధృవపత్రాలలో మెజారిటీని గెలుచుకుంది.Qpcrకిట్ V2, నాణ్యత అనేది ఫ్యాక్టరీ జీవితం , కస్టమర్ డిమాండ్‌పై దృష్టి పెట్టడం కంపెనీ మనుగడ మరియు అభివృద్ధికి మూలం, మేము మీ రాక కోసం ఎదురు చూస్తున్న నిజాయితీ మరియు చిత్తశుద్ధితో పని చేసే వైఖరికి కట్టుబడి ఉంటాము!
మేము అనుభవజ్ఞులైన తయారీదారుని కలిగి ఉన్నాము.దాని మార్కెట్ యొక్క కీలకమైన ధృవపత్రాలలో మెజారిటీని గెలుచుకుందిచైనా టాక్ DNA పాలిమరేస్, Qpcr, మా కంపెనీ వాగ్దానం చేస్తుంది: సరసమైన ధరలు, తక్కువ ఉత్పత్తి సమయం మరియు సంతృప్తికరమైన అమ్మకాల తర్వాత సేవ, మీరు కోరుకున్న ఏ సమయంలోనైనా మా ఫ్యాక్టరీని సందర్శించడానికి మేము మిమ్మల్ని స్వాగతిస్తున్నాము.ఇప్పుడు మేము కలిసి ఆహ్లాదకరమైన మరియు దీర్ఘకాలిక వ్యాపారాన్ని కలిగి ఉండాలని కోరుకుంటున్నాము!!!

వివరణలు

ఈ కిట్ ఒక ప్రత్యేకమైన లైసిస్ బఫర్ సిస్టమ్‌ను ఉపయోగిస్తుంది, ఇది RT-qPCR ప్రతిచర్యల కోసం కల్చర్డ్ సెల్ నమూనాల నుండి RNAను త్వరగా విడుదల చేయగలదు, తద్వారా సమయం తీసుకునే మరియు శ్రమతో కూడిన RNA శుద్ధి ప్రక్రియను తొలగిస్తుంది.RNA టెంప్లేట్ కేవలం 7 నిమిషాల్లో పొందవచ్చు.కిట్ అందించిన 5×డైరెక్ట్ RT మిక్స్ మరియు 2×డైరెక్ట్ qPCR మిక్స్-SYBR రియాజెంట్‌లు రియల్ టైమ్ క్వాంటిటేటివ్ PCR ఫలితాలను త్వరగా మరియు ప్రభావవంతంగా పొందవచ్చు.

5×డైరెక్ట్ RT మిక్స్ మరియు 2×డైరెక్ట్ qPCR మిక్స్-SYBR బలమైన ఇన్హిబిటర్ టాలరెన్స్‌ను కలిగి ఉంటాయి మరియు నమూనాల లైసేట్ నేరుగా RT-qPCR కోసం టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించవచ్చు.ఈ కిట్‌లో ప్రత్యేకమైన RNA హై-అఫినిటీ ఫోర్జీన్ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ మరియు హాట్ D-Taq DNA పాలిమరేస్, dNTPs, MgCl ఉన్నాయి.₂, రియాక్షన్ బఫర్, PCR ఆప్టిమైజర్ మరియు స్టెబిలైజర్.

స్పెసిఫికేషన్లు

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

కిట్ భాగాలు

ఫీచర్లు & ప్రయోజనాలు

■ సింపుల్ మరియు ఎఫెక్టివ్ : సెల్ డైరెక్ట్ RT టెక్నాలజీతో, RNA నమూనాలను కేవలం 7 నిమిషాల్లో పొందవచ్చు.

■ నమూనా డిమాండ్ తక్కువగా ఉంది, 10 సెల్‌లను పరీక్షించవచ్చు.

■ అధిక నిర్గమాంశం: ఇది 384, 96, 24, 12, 6-బావి పలకలలో కల్చర్ చేయబడిన కణాలలో RNAను త్వరగా గుర్తించగలదు.

■ DNA ఎరేజర్ విడుదలైన జన్యువులను త్వరగా తొలగించగలదు, తదుపరి ప్రయోగాత్మక ఫలితాలపై ప్రభావాన్ని బాగా తగ్గిస్తుంది.

■ ఆప్టిమైజ్ చేసిన RT మరియు qPCR సిస్టమ్ రెండు-దశల RT-PCR రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌ను మరింత సమర్థవంతంగా మరియు PCRని మరింత నిర్దిష్టంగా చేస్తుంది మరియు RT-qPCR రియాక్షన్ ఇన్‌హిబిటర్‌లకు మరింత నిరోధకతను కలిగిస్తుంది.

కిట్ అప్లికేషన్

అప్లికేషన్ యొక్క పరిధి: కల్చర్డ్ సెల్స్.

- నమూనా లైసిస్ ద్వారా విడుదల చేయబడిన RNA: ఈ కిట్ యొక్క RT-qPCR టెంప్లేట్‌కు మాత్రమే వర్తిస్తుంది.

- కిట్‌ని కింది ప్రయోజనాల కోసం ఉపయోగించవచ్చు: జన్యు వ్యక్తీకరణ విశ్లేషణ, siRNA-మధ్యవర్తిత్వ జీన్ సైలెన్సింగ్ ఎఫెక్ట్ యొక్క ధృవీకరణ, డ్రగ్ స్క్రీనింగ్ మొదలైనవి.

రేఖాచిత్రం

నిల్వ మరియు షెల్ఫ్ జీవితం

ఈ కిట్ యొక్క భాగం I 4℃ వద్ద నిల్వ చేయాలి;పార్ట్ II -20℃ వద్ద నిల్వ చేయాలి.

Foregene Protease Plus II 4℃ వద్ద నిల్వ చేయాలి, -20℃ వద్ద స్తంభింపజేయవద్దు.

రియాజెంట్ 2×డైరెక్ట్ qPCR మిక్స్-SYBR చీకటిలో -20℃ వద్ద నిల్వ చేయాలి;తరచుగా ఉపయోగించినట్లయితే, ఇది స్వల్పకాలిక నిల్వ కోసం 4℃ వద్ద కూడా నిల్వ చేయబడుతుంది (10 రోజులలోపు ఉపయోగించండి).మేము అనుభవజ్ఞుడైన తయారీదారుని కలిగి ఉన్నాము.Wining the major in the crucial certifications of its market for Big discounting China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, నాణ్యత ఫ్యాక్టరీ 'జీవితం , కస్టమర్' డిమాండ్‌పై దృష్టి పెట్టండి కంపెనీ మనుగడ మరియు అభివృద్ధి యొక్క మూలం, We adhere to honesty and good faith working attitude, looking forward to your coming !
పెద్ద తగ్గింపుచైనా టాక్ DNA పాలిమరేస్, Qpcr, మా కంపెనీ వాగ్దానం చేస్తుంది: సహేతుకమైన ధరలు, తక్కువ ఉత్పత్తి సమయం మరియు సంతృప్తికరమైన అమ్మకాల తర్వాత సేవ, మీరు కోరుకున్న ఏ సమయంలోనైనా మా ఫ్యాక్టరీని సందర్శించడానికి మేము మిమ్మల్ని స్వాగతిస్తున్నాము.ఇప్పుడు మేము కలిసి ఆహ్లాదకరమైన మరియు దీర్ఘకాలిక వ్యాపారాన్ని కలిగి ఉండాలని కోరుకుంటున్నాము!!!

QuickEఅసిTM Cell Direct RT-qPCR Kit -తక్మ్an

Cat.No.DRT-01021/01022

సెల్ డైరెక్ట్ RT-qPCR కోసం ≤ 1000,000 సెల్‌లను ఉపయోగిస్తుంది

ఉత్పత్తి పరిచయం

ఈ ఉత్పత్తి RT-qPCR ప్రతిచర్యల కోసం కల్చర్డ్ సెల్ నమూనాల నుండి RNAని త్వరగా విడుదల చేయడానికి ప్రత్యేకమైన లైసిస్ బఫర్ సిస్టమ్‌ను ఉపయోగిస్తుంది, సమయం తీసుకునే మరియు శ్రమతో కూడిన RNA శుద్దీకరణ ప్రక్రియను తొలగిస్తుంది మరియు 5× డైరెక్ట్ RT మిక్స్‌తో అవసరమైన RNA టెంప్లేట్‌ను పొందేందుకు కేవలం 7 నిమిషాలు, 2× డైరెక్ట్ qPCR మిక్స్, 2× ప్రత్యక్ష qPCR ఫలితాలను త్వరగా పొందవచ్చు.

5× డైరెక్ట్ RT మిక్స్ మరియు 2× డైరెక్ట్ qPCR మిక్స్-తక్మాన్ బలమైన ఇన్హిబిటర్ టాలరెన్స్ కలిగి ఉంటాయి మరియు టెంప్లేట్‌గా కొలవడానికి నమూనా యొక్క లైసేట్‌ను ఉపయోగించి సమర్థవంతమైన రివర్సల్ మరియు నిర్దిష్ట యాంప్లిఫికేషన్‌ను చేయగలవు.రియాజెంట్‌లో ఫోర్‌జీన్ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్, హాట్ డి-టాక్ DNA పాలిమరేస్, dNTPs, MgCl ఉన్నాయి₂, రియాక్షన్ బఫర్, PCR ఆప్టిమైజర్ మరియు స్టెబిలైజర్, ఇది లైసిస్ బఫర్‌తో త్వరితంగా మరియు సులభంగా నమూనాలను గుర్తించడానికి ఉపయోగించవచ్చు మరియు అధిక సున్నితత్వం, నిర్దిష్టత మరియు స్థిరత్వం యొక్క లక్షణాలను కలిగి ఉంటుంది.

ఉత్పత్తి లక్షణాలు

సాధారణ, ప్రభావవంతమైన సెల్ డైరెక్ట్ RT సాంకేతికత RNA నమూనాలను పొందడానికి 7 నిమిషాల కంటే తక్కువ సమయం పడుతుంది.

నమూనా అవసరాలు చిన్నవి మరియు కనీసం 10 కల్చర్డ్ సెల్‌లను ప్రయోగం కోసం ఉపయోగించవచ్చు.

384, 96, 24, 12, మరియు 6-వెల్ ప్లేట్లు వంటి కల్చర్డ్ కణాల వేగవంతమైన RNA సముపార్జన కోసం అధిక నిర్గమాంశ.

DNA ఎరేజర్ విడుదలైన జన్యువులను త్వరగా తొలగించగలదు, తదుపరి ప్రయోగాత్మక ఫలితాలపై ప్రభావాన్ని బాగా తగ్గిస్తుంది.

ఆప్టిమైజ్ చేసిన RT మరియు qPCR సిస్టమ్‌లు రెండు-దశల RT-PCRని మరింత సమర్థవంతమైన రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్, నిర్దిష్టత మరియు బలమైన RT-qPCR రియాక్షన్ ఇన్హిబిటర్ టాలరెన్స్‌తో ప్రారంభిస్తాయి.

కిట్ అప్లికేషన్

అప్లికేషన్ యొక్క పరిధి: కల్చర్డ్ సెల్స్.

నమూనా లైసిస్ అన్వయించబడిన RNA: రెండు-దశల RT-qPCR టెంప్లేట్‌గా మాత్రమే ఉపయోగించబడుతుంది.

కిట్‌లను కింది ప్రయోజనాల కోసం ఉపయోగించవచ్చు: జన్యు నియంత్రణ వ్యక్తీకరణ విశ్లేషణ, యుగ్మ వికల్ప పరీక్ష, డ్రగ్ స్క్రీనింగ్ మొదలైనవి.

కిట్ పరిమితులు

విస్తరించిన శకలాలు ≤ 300 bp.

కిట్‌లను తాజాగా కల్చర్ కణాలకు ఉపయోగిస్తారు.

ఉత్పత్తి నాణ్యత నియంత్రణ

FOREGENE యొక్క టోటల్ క్వాలిటీ మేనేజ్‌మెంట్ సిస్టమ్ ప్రకారం, ప్రతి బ్యాచ్ కిట్‌ల నాణ్యత యొక్క విశ్వసనీయత మరియు స్థిరత్వాన్ని నిర్ధారించడానికి సెల్ డైరెక్ట్ RT-qPCR సిరీస్ కిట్‌ల యొక్క ప్రతి బ్యాచ్ అనేకసార్లు కఠినంగా పరీక్షించబడుతుంది.

కిట్ కంటెంట్‌లు

*:సెల్ లిసిస్, 5×డైరెక్ట్ RT మిక్స్, 2× డైరెక్ట్ qPCR మిక్స్-తక్మాన్ విడిగా కొనుగోలు చేయవచ్చు, వివరాలు అనుబంధం 1 (పేజీ 13)లో అందించబడ్డాయి.

నిల్వ పరిస్థితులు

1. షిప్పింగ్ పరిస్థితులు

కిట్ <4 °C స్థితిలో ఉండేలా చూసేందుకు, తక్కువ ఉష్ణోగ్రత ఐస్ ప్యాక్ బాక్స్ రవాణా మొత్తం ప్రక్రియ.

2. నిల్వ పరిస్థితులు

పార్ట్ Iని 4°C వద్ద మరియు పార్ట్ IIని -20°C వద్ద నిల్వ చేయండి.

Foregene Protease Plus II 4°C వద్ద నిల్వ చేయబడాలి, -20°C వద్ద స్తంభింపజేయకూడదు.

రియాజెంట్ 2× డైరెక్ట్ qPCR Mix-Taqman తరచుగా ఉపయోగించినట్లయితే (10 రోజులలోపు) స్వల్పకాలిక ఉపయోగం కోసం -20°C వద్ద లేదా 4°C వద్ద నిల్వ చేయబడుతుంది.

కిట్ భాగం సమాచారం

బఫర్ CL: సెల్ లైసిస్ ప్రతిచర్యలకు అవసరమైన వాతావరణాన్ని అందిస్తుంది.

బఫర్ ST: తదుపరి RT పై ప్రభావాలను నివారించడానికి లైసేట్‌లోని క్రియాశీల పదార్థాన్ని తొలగిస్తుంది.

DNA ఎరేజర్: DNA రిమూవర్, తదుపరి ప్రయోగాలపై జన్యువును తొలగించే ప్రభావం.

5× డైరెక్ట్ RT మిక్స్: అధిక RNA అఫినిటీ ఫోర్జీన్ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్, RNase ఇన్హిబిటర్, dNTPలు, స్టెబిలైజర్‌లు, ఎన్‌హాన్సర్‌లు, ఆప్టిమైజర్‌లు మరియు ఆప్టిమల్ అలైన్‌మెంట్ కోసం రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ప్రైమర్‌లను కలిగి ఉంటుంది (రాండమ్ ప్రైమర్, ఒలిగో(dT)₁₈ప్రైమర్).

ఫోర్జీన్ ప్రోటీజ్ ప్లస్ II: లైసిస్ బఫర్ సందర్భంలో, కణాలు న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాలను విడుదల చేయడానికి లైస్ చేయబడతాయి.

2× డైరెక్ట్ qPCR మిక్స్-తక్మాన్: ఈ రియాజెంట్ హాట్ D-Taq DNA పాలిమరేస్, dNTPs, MgCl కలిగి ఉంటుంది₂, రియాక్షన్ బఫర్, PCR ఆప్టిమైజర్ మరియు స్టెబిలైజర్.

20× ROX రిఫరెన్స్ డై: సాధారణంగా ABI, స్ట్రాటజీన్ మరియు ఇతర కంపెనీల రియల్ టైమ్ PCR యాంప్లిఫికేషన్ సాధనాల్లో ఉపయోగించబడుతుంది, ఇది PCR డోసింగ్ లోపాల వల్ల కలిగే PCR ట్యూబ్‌లు మరియు ట్యూబ్‌ల మధ్య వ్యత్యాసాన్ని సర్దుబాటు చేయడానికి ఉపయోగించబడుతుంది.వివిధ పరికరాలకు అవసరమైన 20× ROX రెఫరెన్స్ డై ఏకాగ్రత భిన్నంగా ఉంటుంది మరియు పరికరం సిఫార్సు చేసిన ఏకాగ్రత ప్రకారం వినియోగదారు దానిని జోడించవచ్చు.

RNase-ఉచిత ddH₂O: రెండు-దశల RT-qPCR ప్రతిచర్యల కోసం RNase-రహిత స్టెరిలైజ్డ్ అల్ట్రా ప్యూర్ వాటర్.

ముందుజాగ్రత్తలు:(కిట్‌ని ఉపయోగించే ముందు జాగ్రత్తలను జాగ్రత్తగా చదవండి)

నమూనాల మధ్య క్రాస్-కాలుష్యాన్ని నివారించడానికి ప్రయోగం యొక్క ఆపరేషన్ పద్ధతికి శ్రద్ధ వహించండి.

RNase కాలుష్యం మరియు RNA క్షీణతను నివారించడానికి ప్రయోగాత్మక వాతావరణం మరియు పాత్రల శుభ్రతపై శ్రద్ధ వహించండి.

తాజా లేదా బాగా సంరక్షించబడిన సెల్ నమూనాలను తీసుకోండి మరియు పునరావృతమయ్యే ఫ్రీజ్-థావ్డ్ సెల్ నమూనాలను ఎప్పుడూ ఉపయోగించవద్దు.

5× డైరెక్ట్ qPCR మిక్స్,2× డైరెక్ట్ qPCR మిక్స్-తక్మాన్ పదేపదే ఫ్రీజ్-థావ్‌ను నివారించాలి, లేకుంటే అది రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ మరియు PCR సామర్థ్యాన్ని ప్రభావితం చేస్తుంది.

సిద్ధంరేషన్లుముందుఆపరేషన్

ఈ కిట్‌ని ఉపయోగించే ముందు సూచనలను జాగ్రత్తగా చదవండి.సెల్ డైరెక్ట్ RT-qPCR కిట్ సరళమైనది, అనుకూలమైనది మరియు వేగంగా పనిచేయడంతోపాటు మొత్తం కిట్ గురించి మరియు దానిని ఎలా సరిగ్గా ఉపయోగించాలి అనే పూర్తి సమాచారాన్ని సూచనలు అందిస్తాయి.దయచేసి ఉపయోగించే ముందు అవసరమైన ప్రయోగాత్మక పదార్థాలు మరియు సామగ్రిని సిద్ధం చేయండి.

ప్రయోగాత్మక పదార్థాలు మరియు పరికరాలు

◆ సంస్కృతి కణాలు.

◆ 1.5 ml లేదా 2 ml, RNase-/DNase-ఫ్రీ సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్, RNase-/DNase-ఫ్రీ టిప్, 0.2 ml స్టెరైల్ qPCR ట్యూబ్.

◆ qPCR యంత్రం, పైపెట్, టేబుల్‌టాప్ సెంట్రిఫ్యూజ్ (≥13,400×g) (ప్రయోగాత్మక అవసరాలను బట్టి) మొదలైనవి.

భద్రత

◆ ఈ ఉత్పత్తి శాస్త్రీయ పరిశోధన ప్రయోజనాల కోసం మాత్రమే, దయచేసి దీనిని ఫార్మాస్యూటికల్, క్లినికల్, ఫుడ్ మరియు కాస్మెటిక్ ప్రయోజనాల కోసం ఉపయోగించవద్దు.

◆ రసాయనాలను ఉపయోగించినప్పుడు, తగిన ల్యాబ్ బట్టలు, చేతి తొడుగులు, రక్షణ అద్దాలు మొదలైనవి ధరించండి.

ఆపరేషన్మార్గదర్శకులు

అనుబంధం 1 (పేజీ 13)లోని వివరాల కోసం సెల్ లిసిస్ సిస్టమ్‌లు, RT సిస్టమ్‌లు మరియు qPCR రియాక్షన్ సొల్యూషన్ సప్లిమెంట్ ప్యాక్‌లను విడిగా కొనుగోలు చేయవచ్చు.

ఆపరేషన్ గైడ్

A: నమూనా RNA విడుదల

1.కణాలు ముందుగా చికిత్స చేయబడ్డాయి: సెల్ కల్చర్ ప్లేట్‌ను కోల్డ్ PBSతో కడగాలి, ఆపై కణాలను లైజ్ చేయండి (10-10⁶), 10⁶ కణాల మొత్తం కంటే, RNA వెలికితీత మరియు శుద్దీకరణ కోసం ఫోర్జీన్ ది సెల్ మరియు RNA ఐసోలేషన్ కిట్ మొత్తం (DE-03111) లేదా యానిమల్ టోటల్ RNA ఐసోలేషన్ కిట్ (DE-03011) సిఫార్సు చేయబడింది.

1.1అనుబంధ కణాలు (24- బావి ప్లేట్ ఉదాహరణగా)

1.1.1ప్రతి బావిలోని కణాల సంఖ్యను నిర్ణయించండి, కణాల సంఖ్య 1 × 10 అని నిర్ణయించండి⁵, మరియు కల్చర్ డిష్ నుండి కల్చర్ మాధ్యమాన్ని తీసివేయడానికి పైపెట్ ఉపయోగించండి.

1.1.2ప్రతి బావికి 200 μl ముందుగా చల్లబడిన 1 × PBSని జోడించండి.పదేపదే పైప్ చేయవద్దు మరియు బావుల నుండి PBSని తీసివేయండి.ప్లేట్‌ను వంచి, వీలైనంత ఎక్కువ PBSని తీసివేయండి.2వ దశకు వెళ్లండి.

1.1.3సెల్ కల్చర్ డిష్‌లో వివిధ సెల్ కల్చర్ డిష్ లేదా రిఫరెన్స్ నంబర్ టేబుల్ 1-1 సెల్ వాషింగ్ కోసం ప్రీకూల్డ్ 1 × PBS జోడించబడింది.

టేబుల్ 1-1: వివిధ సంఖ్యల కణాల కోసం PBS మోతాదు

గమనిక:దృఢంగా అంటిపెట్టుకునే కణాలను నిర్ధారించడానికి,కడిగేటప్పుడు పెద్ద సంఖ్యలో సెల్ నష్టం నివారించబడుతుంది.

1.2నాన్-పోరస్ ప్లేట్లలో కల్చర్ చేయబడిన సస్పెన్షన్ కణాలు లేదా అంటిపట్టుకొన్న కణాలు

1.2.1నాన్-మల్టీ వెల్ ప్లేట్‌లలో కల్చర్ చేయబడిన అనుబంధ కణాలు (సస్పెన్షన్ కణాలు తదుపరి దశ 1.2.2 నుండి ప్రారంభమవుతాయి), సాధారణ సెల్ సేకరణ పద్ధతి ప్రకారం కణాలను సేకరించి వేరు చేయండి మరియు వాటిని కల్చర్ ప్లేట్ లేదా సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లో ఉంచండి;ట్రిప్సినైజేషన్ ఉపయోగించినట్లయితే, కణాలను సేకరించడానికి మరియు అవశేష ట్రిప్సిన్‌ను తొలగించడానికి సెంట్రిఫ్యూగేషన్ అవసరం, కణాలను చెదరగొట్టడానికి PBS తిరిగి అమర్చిన కణాలను వ్యక్తిగత కణాలలోకి జోడించారు.

1.2.2గణించిన కణాల సంఖ్య తర్వాత, ఆల్కేటెడ్ కణాలు 1×10⁵ సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లకు ఒకటి, 10 నిమిషాలకు 1000 × g వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా కణాలను సేకరించండి.

1.2.3సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌కు 200 μl PBSని జోడించండి, పదే పదే పైప్ చేయకండి మరియు నేరుగా PBSని ఆశించండి.2వ దశకు వెళ్లండి. (అవక్షేపించడం కష్టంగా ఉండి, కణాలు మళ్లీ మళ్లీ అమర్చబడితే, సూపర్‌నాటెంట్‌ను విస్మరించిన 10 నిమిషాల తర్వాత 1000×g సెంట్రిఫ్యూజ్‌ని ప్రదర్శించవచ్చు, సెల్ గుళిక 2వ దశకు చేరుకుంటుంది)

2.సెల్ లైసిస్: బఫర్ CLని తీసివేయండి, దాని ఉష్ణోగ్రత గది ఉష్ణోగ్రతకు సమం చేయబడుతుంది, DNA ఎరేజర్ మరియు ఫోర్జీన్ ప్రోటీజ్ ప్లస్ II, కింది పట్టిక 1-2 సిద్ధం చేసిన లిసిస్ సిస్టమ్ ప్రకారం: (లైసిస్ సొల్యూషన్ ఉపయోగం కోసం సిద్ధంగా ఉంది).

టేబుల్ 1-2: చీలిక సిస్టమ్ తయారీ (గమనిక: మంచు మీద తయారీలో)

3.( 24 –బావి ప్లేట్ ఉదాహరణగా ) పైపెట్ 200 μl సెల్ లైసిస్ మాస్టర్‌ను ప్రతి బావిలో కలపండి, పదేపదే 5-10 సార్లు ఊదండి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద (20-25 ℃) 5 నిమిషాలు పొదిగేది.

గమనిక:బుడగలు ఏర్పడకుండా ఉండేందుకు, పైపెట్ స్కేల్ 200μl లేదా అంతకంటే తక్కువకు సర్దుబాటు చేయబడినప్పుడు దయచేసి.లైసిస్ తర్వాత కణాలు మబ్బుగా కనిపించవచ్చు, ఇది సాధారణం.

4.(24 –బావి ప్లేట్ ఉదాహరణగా ) లిక్విడ్ 20 μl బఫర్ ST (టేబుల్ 1-3లో చూపిన మొత్తంలో బఫర్ ST జోడించబడిన వివిధ లైసిస్ సిస్టమ్స్) జోడించబడింది, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద (20-25 ℃) 5-10 సార్లు పునరావృత పైపులు వేయడం 2 నిమిషాలు పొదిగేది .

గమనిక:పైపెట్ చిట్కా ఉపరితలం క్రింద పారవేయబడి, లైసేట్ జోడించబడిందని నిర్ధారిస్తుంది,బుడగలు ఏర్పడకుండా ఉండటానికి, దయచేసి పైపెట్ స్కేల్ 200μl లేదా అంతకంటే తక్కువకు సర్దుబాటు చేయబడినప్పుడు.

పట్టిక 1-3:బఫర్ STని జోడించండి

5. లైసేట్ తదుపరి RT-qPCR ప్రయోగాలకు ఉపయోగించబడుతుంది.తదుపరి ప్రయోగాలు సకాలంలో చేయలేకపోతే, దయచేసి దానిని మంచు మీద 2 గంటల కంటే ఎక్కువసేపు ఉంచండి మరియు -20℃ లేదా -80 ℃ వద్ద నిల్వ చేయండి (మూడు నెలల కంటే ఎక్కువ కాదు).

B: RT వ్యవస్థ తయారీ

1. 5 × డైరెక్ట్ RT మిక్స్‌ని తీసి ఐస్ బాత్‌పై ఉంచండి, అది సహజంగా కరిగిపోనివ్వండి మరియు తరువాత ఉపయోగం కోసం మెత్తగా కలపండి;RNase-Free ddH2O తీసి, దానిని కరిగించి, తర్వాత ఉపయోగం కోసం ఐస్ బాత్‌పై ఉంచండి.దిగువ పట్టిక 2-1 ప్రకారం మంచుపై ప్రతిచర్య వ్యవస్థను సిద్ధం చేయండి.

టేబుల్ 2-1: RT ప్రతిచర్య వ్యవస్థ తయారీ

2.సిస్టమ్ ఫార్ములేషన్ పూర్తయిన తర్వాత, కింది పట్టిక 2 -2 రియాక్షన్ షరతులు RT రియాక్షన్‌లో క్లుప్తంగా మెత్తగా మిక్స్ చేసి సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడింది.

టేబుల్ 2-2: RT రియాక్షన్ కండిషన్ సెట్టింగ్

3.రియాక్షన్ పూర్తయిన తర్వాత, రియాక్షన్ ప్రొడక్ట్ నేరుగా qPCR కోసం మంచు మీద ఉంచబడింది, దయచేసి దీర్ఘకాలిక సంరక్షణ -20℃ లేదా -80 ℃ ఉంచండి.

గమనిక: నాన్-ప్యూరిఫైడ్ టెంప్లేట్ ఉపయోగించడం వల్ల, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ప్రోడక్ట్‌లో తెలుపు అవక్షేపాలు కనిపించవచ్చు.ఇది సాధారణ దృగ్విషయం.తదుపరి ప్రయోగాల కోసం సూపర్‌నాటెంట్‌ను వెంటనే సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయండి.

ఫలితంగా వచ్చే RT రియాక్షన్ సొల్యూషన్ తదుపరి దశ రియల్ టైమ్ PCR రియాక్షన్ సిస్టమ్‌లకు జోడించబడుతుంది, రియాక్షన్ సిస్టమ్‌లో 10-30% వరకు మొత్తాలను జోడించాలని సిఫార్సు చేయబడింది.

సి: qPCR ప్రతిచర్య వ్యవస్థ తయారీ

1. ప్రతిచర్య వ్యవస్థను సిద్ధం చేయడానికి క్రింది పట్టిక 3-1 ప్రకారం దశ cDNA టెంప్లేట్‌లో తగిన మొత్తంలో B సిద్ధం చేయబడింది.

గమనిక: cDNA టెంప్లేట్ మొత్తం qPCR సిస్టమ్‌లో 10-30% వరకు ఉంటుంది.ఉదాహరణకు, 20μl qPCR సిస్టమ్‌లో, 2-6 μl లైసిస్ బఫర్‌ని జోడించండి, కానీ 6 μl కంటే ఎక్కువ కాదు.

2. qPCR ప్రతిచర్యకు అనుకూలమైన మంచి qPCR పరిస్థితులు (అనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత，మొదలైనవి) (టేబుల్ 3-2లో ఇవ్వబడిన ప్రతిచర్య పరిస్థితులు).

గమనిక: మెరుగైన ఫలితాలను పొందడానికి qPCR ప్రతిచర్యల కోసం ఆప్టిమైజ్ చేసిన పరిస్థితులను ఉపయోగించడానికి ప్రయత్నించండి.

టేబుల్ 3-1: PCR ప్రతిచర్య వ్యవస్థ తయారీ

1*: ప్రైమర్ రియాక్షన్ పనితీరు పేలవంగా ఉన్నప్పుడు ప్రైమర్ ఏకాగ్రతను 50-900 nM పరిధిలో సర్దుబాటు చేయవచ్చు.

గమనిక: qPCR సిస్టమ్‌ను ప్రయోగాత్మక అవసరాలు మరియు ఫ్లోరోసెన్స్ సైక్లర్ మోడల్‌కు అనుగుణంగా సర్దుబాటు చేయవచ్చు.50లో qPCR కోసంμl వ్యవస్థ, రియాజెంట్ మోతాదును 20 ప్రకారం దామాషా ప్రకారం సర్దుబాటు చేయండిμl వ్యవస్థ.

2*: ఫ్లోరోసెన్స్ క్వాంటిటేటివ్ థర్మల్ సైక్లర్ ప్రకారం ROX రిఫరెన్స్ డై యొక్క సరైన తుది సాంద్రతను ఎంచుకోండి.సాధారణ ఫ్లోరోసెన్స్ క్వాంటిటేటివ్ సైక్లర్‌ల కోసం అత్యంత సముచితమైన ROX రిఫరెన్స్ డై సాంద్రతలు క్రింది పట్టికలో చూపబడ్డాయి:

టేబుల్ 3-2: qPCR ప్రతిచర్య పరిస్థితులు అందించబడ్డాయి

గమనిక: ఉత్తమ qPCR ప్రభావాన్ని పొందేందుకు, వివిధ టెంప్లేట్‌లు మరియు విభిన్న ప్రైమర్‌ల కోసం ప్రతిచర్య పరిస్థితులను ఆప్టిమైజ్ చేయడానికి గ్రేడియంట్ PCRని ఉపయోగించవచ్చు.PCR ప్రతిచర్య పరిస్థితులు ఫ్లోరోసెన్స్ ఎనలైజర్, టెంప్లేట్, ప్రైమర్ మొదలైన వాటిపై ఆధారపడి మారుతూ ఉంటాయి. నిర్దిష్ట ఆపరేషన్‌లో, ఫ్లోరోసెన్స్ క్వాంటిటేటివ్ థర్మల్ సైక్లర్, టెంప్లేట్ రకం, ఆసక్తి ముక్క యొక్క పరిమాణం, యాంప్లిఫైడ్ ఫ్రాగ్‌మెంట్ యొక్క బేస్ సీక్వెన్స్ మరియు GC రియాక్షన్ యొక్క సమయ శ్రేణి యొక్క నిర్దిష్ట పరిస్థితులకు అనుగుణంగా సరైన ప్రతిచర్య పరిస్థితులను రూపొందించాలి.

రియల్ టైమ్ PCR ప్రైమర్ డిజైన్ సూత్రాలు

ఫార్వర్డ్ ప్రైమర్ మరియు రివర్స్ ప్రైమర్

రియల్ టైమ్ PCR కోసం, ప్రైమర్ డిజైన్ చాలా ముఖ్యం.ప్రైమర్‌లు PCR యాంప్లిఫికేషన్ యొక్క విశిష్టత మరియు సామర్థ్యానికి సంబంధించినవి మరియు క్రింది సూత్రాలకు సంబంధించి రూపొందించబడతాయి:

◆ ప్రైమర్ పొడవు: 18-30bp.

◆ GC కంటెంట్: 40-60%.

◆ Tm విలువ: ప్రైమర్ 5 వంటి ప్రైమర్ డిజైన్ సాఫ్ట్‌వేర్, ప్రైమర్ యొక్క Tm విలువను ఇవ్వగలదు.అప్‌స్ట్రీమ్ మరియు డౌన్‌స్ట్రీమ్ ప్రైమర్‌ల Tm విలువలు వీలైనంత దగ్గరగా ఉండాలి.Tm గణన సూత్రాన్ని కూడా ఉపయోగించవచ్చు: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).PCR చేస్తున్నప్పుడు, ప్రైమర్ Tm విలువ 5 °C కంటే తక్కువ ఉష్ణోగ్రత సాధారణంగా ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతగా ఎంపిక చేయబడుతుంది (ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతలో సంబంధిత పెరుగుదల PCR ప్రతిచర్య యొక్క నిర్దిష్టతను పెంచుతుంది).

◆ ప్రైమర్‌లు మరియు PCR ఉత్పత్తులు:

◆ డిజైన్ ప్రైమర్ PCR యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తి పొడవు 100-150bp.

◆ టెంప్లేట్ యొక్క సెకండరీ స్ట్రక్చరల్ ఏరియాలో డిజైన్ ప్రైమర్‌లను వీలైనంత వరకు నివారించాలి.

◆ అప్‌స్ట్రీమ్ మరియు డౌన్‌స్ట్రీమ్ ప్రైమర్‌ల 3′ చివరల మధ్య 2 లేదా అంతకంటే ఎక్కువ కాంప్లిమెంటరీ బేస్‌ల ఏర్పాటును నివారించండి.

◆ ప్రైమర్ 3′ టెర్మినల్ బేస్ 3 అదనపు వరుస G లేదా Cతో ఉండకూడదు.

◆ ప్రైమర్‌లు పరిపూరకరమైన నిర్మాణాలను కలిగి ఉండవు, లేకుంటే ఒక హెయిర్‌పిన్ నిర్మాణం ఏర్పడుతుంది, ఇది PCR విస్తరణను ప్రభావితం చేస్తుంది.

◆ ATCGని ప్రైమర్ సీక్వెన్స్‌లో వీలైనంత సమానంగా పంపిణీ చేయాలి మరియు 3′ టెర్మినల్ బేస్‌ను T వలె నివారించాలి.

అపెండిక్స్1:Cఅన్ని డైరెక్ట్RT-qPCR కిట్ కంపోనెన్t సప్లిమెంట్ ప్యాక్

1.సెల్ లిసిస్ సొల్యూషన్