పైపెట్ చిట్కాలు మరియు EP ట్యూబ్‌ల స్టెరిలైజేషన్ మొదలైనవి.

1. డీయోనైజ్డ్ నీటితో 0.1% (వెయ్యి వంతు) DEPC (అత్యంత విషపూరితమైన పదార్ధం) సిద్ధం చేయండి, దానిని ఫ్యూమ్ హుడ్‌లో జాగ్రత్తగా ఉపయోగించండి మరియు కాంతి నుండి దూరంగా 4 ° C వద్ద నిల్వ చేయండి;

DEPC నీరు DEPC తో శుద్ధి చేయబడిన స్వచ్ఛమైన నీరు మరియు అధిక ఉష్ణోగ్రత మరియు అధిక పీడనం ద్వారా క్రిమిరహితం చేయబడుతుంది.RNase, DNase మరియు ప్రొటీనేజ్ లేకుండా పరీక్షించబడింది.

2. పైపెట్ చిట్కా మరియు EP ట్యూబ్‌ను 0.1% DEPCలో ఉంచండి మరియు పైపెట్ చిట్కా మరియు EP ట్యూబ్ 0.1% DEPతో నిండి ఉండేలా చూసుకోండి.

3. కాంతి నుండి రక్షించండి, నిలబడనివ్వండి, రాత్రిపూట (12-24గం)

4. చిట్కా మరియు EP ట్యూబ్ ఉన్న పెట్టెను DEPCలో నానబెట్టాల్సిన అవసరం లేదు.చిట్కా లేదా EP ట్యూబ్‌లోని DEPC నీటిని సుమారుగా తీసివేసిన తర్వాత, దానిని ప్యాక్ చేసి, చుట్టండి.

5. 121 డిగ్రీల సెల్సియస్, 30నిమి

6. 180 డిగ్రీల సెల్సియస్, చాలా గంటలు పొడిగా ఉంటుంది (కనీసం 3 గంటలు)

గమనిక: ఎ.DEPCని నిర్వహించేటప్పుడు రబ్బరు తొడుగులు మరియు ముసుగులు ధరించండి!b, లేదా DEPC స్టెరిలైజేషన్ లేకుండా, 130 ℃, 90min ఆటోక్లేవ్ (అనేక ప్రయోగశాలలు రెండుసార్లు అధిక ఉష్ణోగ్రత స్టెరిలైజేషన్)

RNA వెలికితీత పరిగణనలు

కణజాల RNA ఐసోలేషన్ వైఫల్యం యొక్క రెండు ప్రధాన దృగ్విషయాలు

RNA క్షీణత మరియు కణజాలాలలో మలినాలను అవశేషాలు,క్షీణతకు సంబంధించి, కల్చర్డ్ కణాల నుండి సేకరించిన RNA ఎందుకు సులభంగా అధోకరణం చెందదు అని చూద్దాం.ఇప్పటికే ఉన్న RNA వెలికితీత కారకాలు అన్నీ RNaseని వేగంగా నిరోధించే భాగాలను కలిగి ఉంటాయి.కల్చర్డ్ కణాలకు లైసేట్‌ను జోడించి, దానిని కలపండి, అన్ని కణాలను లైసేట్‌తో పూర్తిగా కలపవచ్చు మరియు కణాలు పూర్తిగా లైస్ చేయబడతాయి.కణాలు లైస్ చేయబడిన తర్వాత, లైసేట్‌లోని క్రియాశీల పదార్థాలు వెంటనే కణాంతర RNaseని నిరోధిస్తాయి, కాబట్టి RNA చెక్కుచెదరకుండా ఉంటుంది.అంటే, కల్చర్డ్ కణాలు లైసేట్‌తో సులభంగా మరియు పూర్తిగా సంపర్కించబడినందున, వాటి RNA సులభంగా క్షీణించదు;మరోవైపు, కణజాలంలోని RNA సులభంగా అధోకరణం చెందుతుంది ఎందుకంటే కణజాలంలోని కణాలు లైసేట్‌ను త్వరగా సంప్రదించడం సులభం కాదు.తగినంత పరిచయం కారణంగా.కాబట్టి,RNA కార్యాచరణను నిరోధించేటప్పుడు కణజాలాన్ని ఒకే కణంగా మార్చడానికి ఒక మార్గం ఉందని ఊహిస్తే, క్షీణత సమస్యను పూర్తిగా పరిష్కరించవచ్చు.

లిక్విడ్ నైట్రోజన్ మిల్లింగ్ అటువంటి పద్ధతి అత్యంత ప్రభావవంతమైనది.అయినప్పటికీ, లిక్విడ్ నైట్రోజన్ మిల్లింగ్ పద్ధతి చాలా సమస్యాత్మకంగా ఉంటుంది, ప్రత్యేకించి నమూనాల సంఖ్య పెద్దగా ఉన్నప్పుడు.ఇది తదుపరి ఉత్తమమైన విషయానికి దారితీసింది: హోమోజెనైజర్.దిhomogenizerలైసేట్‌తో కణాలను సంప్రదించడానికి ముందు RNase కార్యాచరణ ఎలా నిరోధించబడుతుందనే ప్రశ్నను ఈ పద్ధతి పరిగణించదు, అయితే కణాంతర RNase RNని క్షీణింపజేసే రేటు కంటే కణజాల అంతరాయం రేటు వేగంగా ఉండాలని ప్రార్థిస్తుంది.

ఎలక్ట్రిక్ హోమోజెనిజర్ ప్రభావం మెరుగ్గా ఉంటుంది,మరియు గ్లాస్ హోమోజెనిజర్ ప్రభావం తక్కువగా ఉంటుంది, కానీ సాధారణంగా, హోమోజెనిజర్ పద్ధతి అధోకరణ దృగ్విషయాన్ని నిరోధించదు.అందువల్ల, వెలికితీత క్షీణించినట్లయితే, ద్రవ నత్రజనితో గ్రౌండింగ్ కోసం అసలు ఎలక్ట్రిక్ హోమోజెనైజర్ను ఉపయోగించాలి;ఒరిజినల్ గ్లాస్ హోమోజెనైజర్‌ని ఎలక్ట్రిక్ హోమోజెనైజర్‌గా మార్చాలి లేదా ద్రవ నైట్రోజన్‌తో నేరుగా మిల్లింగ్ చేయాలి.సమస్య దాదాపు 100% ఆచరణీయమైనది.పరిష్కరించుకుంటారు.

తదుపరి ప్రయోగాలను ప్రభావితం చేసే అశుద్ధ అవశేషాల సమస్య అధోకరణం కంటే విభిన్న కారణాలను కలిగి ఉంటుంది మరియు పరిష్కారాలు తదనుగుణంగా భిన్నంగా ఉంటాయి.ముగింపులో,కణజాలంలో క్షీణత లేదా అవశేష మలినాలను కలిగి ఉంటే, నిర్దిష్ట ప్రయోగాత్మక పదార్థం కోసం వెలికితీత పద్ధతి/రియాజెంట్ తప్పనిసరిగా ఆప్టిమైజ్ చేయబడాలి.ఆప్టిమైజేషన్ కోసం మీరు మీ విలువైన నమూనాలను ఉపయోగించాల్సిన అవసరం లేదు: మీరు మార్కెట్ నుండి చేపలు/కోడి వంటి కొన్ని చిన్న జంతువులను కొనుగోలు చేయవచ్చు, RNA వెలికితీత కోసం పదార్థం యొక్క సంబంధిత భాగాన్ని తీసుకోవచ్చు మరియు ప్రోటీన్ వెలికితీత కోసం ఇతర భాగాన్ని తీసుకోవచ్చు - నోరు, కడుపు మరియు ప్రేగుల సారంతో రుబ్బు.

సంగ్రహించిన RNA యొక్క లక్ష్య RNA వివిధ తదుపరి ప్రయోగాల కోసం ఉపయోగించబడుతుంది మరియు దాని నాణ్యత అవసరాలు భిన్నంగా ఉంటాయి

cDNA లైబ్రరీ నిర్మాణానికి ఎంజైమ్ రియాక్షన్ ఇన్హిబిటర్స్ అవశేషాలు లేకుండా RNA సమగ్రత అవసరం;ఉత్తరానికి అధిక RNA సమగ్రత మరియు ఎంజైమ్ రియాక్షన్ ఇన్హిబిటర్స్ అవశేషాల కోసం తక్కువ అవసరాలు అవసరం;RT-PCRకి అధిక RNA సమగ్రత అవసరం లేదు,కానీ ఎంజైమ్ ప్రతిచర్యలను నిరోధిస్తుంది.అవశేష అవసరాలు కఠినమైనవి.ఇన్పుట్ అవుట్పుట్ను నిర్ణయిస్తుంది;ప్రతిసారీ అత్యధిక స్వచ్ఛత కలిగిన ఆర్‌ఎన్‌ఏను పొందడం లక్ష్యం, అది ప్రజలకు మరియు డబ్బును ఖర్చు చేస్తుంది.

నమూనాల సేకరణ/నిల్వ

క్షీణతను ప్రభావితం చేసే కారకాలు నమూనా జీవ శరీరం/లేదా అసలు పెరుగుదల వాతావరణాన్ని విడిచిపెట్టిన తర్వాత, నమూనాలోని అంతర్జాత ఎంజైమ్‌లు RNA క్షీణించడం ప్రారంభిస్తాయి,మరియు క్షీణత రేటు అంతర్జాత ఎంజైమ్‌లు మరియు ఉష్ణోగ్రత యొక్క కంటెంట్‌కు సంబంధించినది.సాంప్రదాయకంగా, ఎండోజెనస్ ఎంజైమ్ కార్యకలాపాలను పూర్తిగా నిరోధించడానికి కేవలం రెండు మార్గాలు మాత్రమే ఉన్నాయి: వెంటనే లైసేట్‌ను జోడించి, పూర్తిగా మరియు వేగంగా సజాతీయంగా మార్చండి;చిన్న ముక్కలుగా కట్ చేసి వెంటనే ద్రవ నత్రజనిలో స్తంభింపజేయండి.రెండు విధానాలకు వేగవంతమైన ఆపరేషన్ అవసరం.రెండోది అన్ని నమూనాలకు అనుకూలంగా ఉంటుంది, అయితే మునుపటిది తక్కువ కణాలు మరియు ఎండోజెనస్ ఎంజైమ్‌లు మరియు సజాతీయంగా సులభంగా ఉండే కణజాలాలకు మాత్రమే సరిపోతుంది.ప్రత్యేకించి, మొక్కల కణజాలం, కాలేయం, థైమస్, క్లోమం, ప్లీహము, మెదడు, కొవ్వు, కండరాల కణజాలం మొదలైనవి కొనసాగే ముందు ద్రవ నత్రజనితో ఉత్తమంగా స్తంభింపజేయబడతాయి.

నమూనాల ఫ్రాగ్మెంటేషన్ మరియు సజాతీయీకరణ

క్షీణత మరియు దిగుబడి నమూనా ఫ్రాగ్మెంటేషన్‌ను ప్రభావితం చేసే కారకాలుసంపూర్ణ సజాతీయత కోసం, ఇది RNA యొక్క పూర్తి మరియు పూర్తి విడుదల కోసం.కణాలను విచ్ఛిన్నం చేయకుండా నేరుగా సజాతీయంగా మార్చవచ్చు.విరిగిన తర్వాత మాత్రమే కణజాలాలను సజాతీయంగా మార్చవచ్చు.ఈస్ట్ మరియు బ్యాక్టీరియాను సజాతీయంగా మార్చడానికి ముందు సంబంధిత ఎంజైమ్‌లతో విచ్ఛిన్నం చేయాలి.తక్కువ అంతర్జాత ఎంజైమ్ కంటెంట్ మరియు సులభంగా సజాతీయత కలిగిన కణజాలాలను ఒక హోమోజెనైజర్ ద్వారా లైసేట్‌లో ఒక సమయంలో చూర్ణం చేయవచ్చు మరియు సజాతీయంగా మార్చవచ్చు;మొక్కల కణజాలం, కాలేయం, థైమస్, ప్యాంక్రియాస్, ప్లీహము, మెదడు, కొవ్వు, కండరాల కణజాలం మరియు ఇతర నమూనాలు, అవి అంతర్జాత ఎంజైమ్‌లలో ఎక్కువగా ఉంటాయి లేదా సులభంగా సజాతీయంగా ఉండవు,కాబట్టి కణజాలం అంతరాయం మరియు సజాతీయత విడిగా నిర్వహించబడాలి.ఫ్రాగ్మెంటేషన్ యొక్క అత్యంత విశ్వసనీయ మరియు అత్యంత ఉత్పాదక పద్ధతి ద్రవ నత్రజనితో మిల్లింగ్, మరియు సజాతీయీకరణ యొక్క అత్యంత విశ్వసనీయ పద్ధతి ఎలక్ట్రిక్ హోమోజెనైజర్ యొక్క ఉపయోగం.ద్రవ నత్రజనితో మిల్లింగ్ చేయడం గురించి ఒక ప్రత్యేక గమనిక: మొత్తం మిల్లింగ్ ప్రక్రియలో నమూనాను కరిగించకూడదు, ఎందుకంటే అంతర్జాత ఎంజైమ్‌లు స్తంభింపజేసినప్పుడు ఎక్కువగా పని చేస్తాయి.

లైసేట్ ఎంపిక

ఆపరేషన్ యొక్క సౌలభ్యం మరియు అవశేష అంతర్జాత మలినాలను ప్రభావితం చేయడం సాధారణంగా ఉపయోగించే లైసిస్ సొల్యూషన్స్ RNase యొక్క కార్యాచరణను దాదాపుగా నిరోధించగలవు.అందువల్ల, లైసిస్ సొల్యూషన్‌ను ఎంచుకునే ముఖ్య విషయం ఏమిటంటే శుద్దీకరణ పద్ధతితో కలిపి పరిగణించడం.ఒక మినహాయింపు ఉంది:ఎండోజెనస్ ఎంజైమ్‌లను క్రియారహితం చేసే సామర్థ్యాన్ని పెంచడానికి ఫినాల్‌ను కలిగి ఉన్న లైసేట్‌ను ఉపయోగించాలని అధిక ఎండోజెనస్ ఎంజైమ్ కంటెంట్ ఉన్న నమూనాలను సిఫార్సు చేస్తారు.

శుద్దీకరణ పద్ధతి యొక్క ఎంపిక

అవశేష అంతర్జాత మలినాలను ప్రభావితం చేసే కారకాలు, వెలికితీత వేగం కణాల వంటి శుభ్రమైన నమూనాల కోసం, చేతిలో ఉన్న ఏదైనా శుద్దీకరణ పద్ధతితో సంతృప్తికరమైన ఫలితాలను పొందవచ్చు.కానీ అనేక ఇతర నమూనాల కోసం, ముఖ్యంగా మొక్కలు, కాలేయం, బ్యాక్టీరియా మొదలైన అధిక స్థాయి మలినాలను కలిగి ఉన్న వాటికి తగిన శుద్దీకరణ పద్ధతిని ఎంచుకోవడం చాలా ముఖ్యం.కాలమ్ సెంట్రిఫ్యూగల్ ప్యూరిఫికేషన్ పద్ధతి వేగవంతమైన వెలికితీత వేగాన్ని కలిగి ఉంటుంది మరియు RNA యొక్క తదుపరి ఎంజైమాటిక్ ప్రతిచర్యను ప్రభావితం చేసే మలినాలను సమర్థవంతంగా తొలగించగలదు, అయితే ఇది ఖరీదైనది (ఫోరేజీన్ ఖర్చుతో కూడుకున్న కిట్‌లను అందించగలదు, మరిన్ని వివరాలు క్లిక్ చేయండిఇక్కడ);LiCl అవపాతం వంటి ఆర్థిక మరియు క్లాసిక్ శుద్దీకరణ పద్ధతులను ఉపయోగించడం ద్వారా కూడా సంతృప్తికరమైన ఫలితాలను పొందవచ్చు, అయితే ఆపరేషన్ సమయం చాలా ఎక్కువ..

RNA వెలికితీత కోసం "మూడు విభాగాలు మరియు ఎనిమిది శ్రద్ధలు"

క్రమశిక్షణ 1:ఎక్సోజనస్ ఎంజైమ్‌ల కాలుష్యాన్ని అంతం చేయండి.

గమనిక 1:కచ్చితంగా మాస్క్‌లు, గ్లౌజులు ధరించాలి.

గమనిక 2:ప్రయోగానికి సంబంధించిన సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లు, టిప్ హెడ్‌లు, పైపెట్ రాడ్‌లు, ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ట్యాంకులు మరియు ప్రయోగాత్మక బెంచీలను పూర్తిగా పారవేయాలి.

గమనిక 3:ప్రయోగంలో పాల్గొన్న కారకాలు/పరిష్కారాలు, ముఖ్యంగా నీరు, తప్పనిసరిగా RNase-రహితంగా ఉండాలి.

క్రమశిక్షణ 2:ఎండోజెనస్ ఎంజైమ్‌ల కార్యకలాపాలను నిరోధించండి

గమనిక 4:తగిన సజాతీయీకరణ పద్ధతిని ఎంచుకోండి.

గమనిక 5:తగిన లైసేట్‌ను ఎంచుకోండి.

గమనిక 6:నమూనా యొక్క ప్రారంభ మొత్తాన్ని నియంత్రించండి.

క్రమశిక్షణ 3:మీ వెలికితీత ప్రయోజనాన్ని స్పష్టం చేయండి

గమనిక 7:ఏదైనా లైసేట్ సిస్టమ్ నమూనా యొక్క గరిష్ట ప్రారంభ మొత్తానికి చేరుకోవడంతో, వెలికితీత విజయం రేటు బాగా పడిపోతుంది.

గమనిక 8:విజయవంతమైన RNA వెలికితీతకు ఏకైక ఆర్థిక ప్రమాణం తదుపరి ప్రయోగాలలో విజయం, దిగుబడి కాదు.

RNase కాలుష్యం యొక్క టాప్ 10 మూలాలు

1. ఎక్సోజనస్ ఎంజైమ్‌ల యొక్క మొదటి మూలం వేళ్లు, కాబట్టి చేతి తొడుగులు తరచుగా ధరించాలి మరియు భర్తీ చేయాలి.అదనంగా, ముసుగులు కూడా ధరించాలి, ఎందుకంటే శ్వాస అనేది ఎంజైమ్‌ల యొక్క ముఖ్యమైన మూలం.గ్లోవ్ మాస్క్ ధరించడం వల్ల కలిగే అదనపు ప్రయోజనం ఏమిటంటే ప్రయోగాత్మకుడిని రక్షించడం.

2. పైపెట్ చిట్కాలు, సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లు, పైపెట్‌లు - స్టెరిలైజేషన్ ద్వారా మాత్రమే RNase నిష్క్రియం చేయబడదు, కాబట్టి పైపెట్ చిట్కాలు మరియు సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లు DEPC చికిత్సగా గుర్తించబడినప్పటికీ, వాటిని DEPCతో చికిత్స చేయాలి.ప్రత్యేక ప్రయోజన పైపెట్‌ను ఉపయోగించడం ఉత్తమం, ఉపయోగం ముందు 75% ఆల్కహాల్ కాటన్ బాల్‌తో తుడవండి, ముఖ్యంగా రాడ్;అదనంగా, హెడ్ రిమూవర్‌ని ఉపయోగించకూడదని నిర్ధారించుకోండి.

3. నీరు/బఫర్ తప్పనిసరిగా RNase కాలుష్యం లేకుండా ఉండాలి.

4. కనీసం టెస్ట్ టేబుల్‌ను 75% ఆల్కహాల్ కాటన్ బాల్స్‌తో శుభ్రంగా తుడవాలి.

5.ఎండోజెనస్ RNase అన్ని కణజాలాలు అంతర్జాత ఎంజైమ్‌లను కలిగి ఉంటాయి, కాబట్టి ద్రవ నత్రజనితో కణజాలాలను త్వరగా గడ్డకట్టడం క్షీణతను తగ్గించడానికి ఉత్తమ మార్గం.ద్రవ నత్రజని నిల్వ/గ్రౌండింగ్ పద్ధతి నిజానికి అసౌకర్యంగా ఉంటుంది, అయితే అధిక స్థాయిలో అంతర్జాత ఎంజైమ్‌లు ఉన్న కణజాలాలకు ఇది ఏకైక మార్గం.

6. RNA నమూనాలు RNA వెలికితీత ఉత్పత్తులు RNase కాలుష్యం యొక్క జాడలను కలిగి ఉండవచ్చు.

7. ప్లాస్మిడ్ వెలికితీత ప్లాస్మిడ్ వెలికితీత తరచుగా RNAను అధోకరణం చేయడానికి Rnaseని ఉపయోగిస్తుంది మరియు అవశేష Rnaseని ప్రొటీనేస్ Kతో జీర్ణం చేసి PCI ద్వారా సంగ్రహించాలి.

8. RNA నిల్వ తక్కువ ఉష్ణోగ్రత వద్ద నిల్వ చేయబడినప్పటికీ, RNase యొక్క ట్రేస్ మొత్తాలు RNA క్షీణతకు కారణమవుతాయి.RNA యొక్క దీర్ఘకాలిక సంరక్షణకు ఉత్తమ పరిష్కారం ఉప్పు/ఆల్కహాల్ సస్పెన్షన్, ఎందుకంటే ఆల్కహాల్ తక్కువ ఉష్ణోగ్రతల వద్ద అన్ని ఎంజైమాటిక్ కార్యకలాపాలను నిరోధిస్తుంది.

9. కాటయాన్స్ (Ca, Mg) ఈ అయాన్‌లను కలిగి ఉన్నప్పుడు, 80C వద్ద 5 నిమిషాల పాటు వేడి చేయడం వలన RNA క్లీవ్ అవుతుంది, కాబట్టి RNA వేడి చేయవలసి వస్తే, సంరక్షణ ద్రావణంలో చెలాటింగ్ ఏజెంట్ (1mM సోడియం సిట్రేట్, pH 6.4) ఉండాలి.

10. తదుపరి ప్రయోగాలలో ఉపయోగించే ఎంజైమ్‌లు RNase ద్వారా కలుషితమై ఉండవచ్చు.

RNA వెలికితీత కోసం 10 చిట్కాలు

1: RNase కార్యాచరణను త్వరగా నిరోధించండి.సేకరణ తర్వాత నమూనాలు త్వరగా స్తంభింపజేయబడతాయి మరియు లైసిస్ సమయంలో వేగవంతమైన ఆపరేషన్ ద్వారా RNase నిష్క్రియం చేయబడుతుంది.

2: అధిక రిబోజైమ్ కంటెంట్ ఉన్న కణజాలం కోసం తగిన వెలికితీత పద్ధతిని ఎంచుకోండి మరియు కొవ్వు కణజాలం ఫినాల్ కలిగి ఉన్న పద్ధతిని ఉపయోగించడం ఉత్తమం.

3: ప్రిడిక్షన్ నాణ్యతకు ఉత్తరం అవసరం, cDNA లైబ్రరీ నిర్మాణానికి అధిక సమగ్రత అవసరం మరియు RT-PCR మరియు RPA (Ribonuclease protection assay)కి అధిక సమగ్రత అవసరం లేదు.RT-PCRకి అధిక స్వచ్ఛత (ఎంజైమ్ ఇన్హిబిటర్ అవశేషాలు) అవసరం.

4: దిగుబడిని మెరుగుపరచడానికి మరియు క్షీణతను తగ్గించడానికి సంపూర్ణ సజాతీయీకరణ కీలకం.

5: RNA ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ గుర్తింపు యొక్క సమగ్రతను తనిఖీ చేయండి, 28S: 18S = 2: 1 అనేది పూర్తి సంకేతం, 1: 1 అనేది చాలా ప్రయోగాలకు కూడా ఆమోదయోగ్యమైనది.

6: RT-PCR కోసం DNA యొక్క తొలగింపు, శ్రేణి విశ్లేషణ DNA తొలగించడానికి Dnase Iని ఉపయోగించడం ఉత్తమం.

7: ఎక్సోజనస్ ఎంజైమ్‌ల కలుషితాన్ని తగ్గించండి - ఎంజైమ్‌లు బయటి నుండి దిగుమతి చేయబడవు.

8: తక్కువ గాఢత కలిగిన న్యూక్లియిక్ యాసిడ్‌ను కేంద్రీకరించేటప్పుడు, సహ-అవక్షేపణ కారకాన్ని జోడించాలి.కానీ ఎంజైమ్‌లు మరియు DNA కాలుష్యాన్ని కలిగి ఉన్న సహ-అవక్షేపణను నిరోధించడానికి.

9: RNAని పూర్తిగా కరిగించండి, అవసరమైతే, 65C వద్ద 5 నిమిషాలు వేడి చేయండి.

తగిన నిల్వ పద్ధతి

ఇది -20C వద్ద తక్కువ సమయం మరియు -80C వద్ద ఎక్కువ కాలం నిల్వ చేయవచ్చు.ఆర్‌ఎన్‌ఏ దిగుబడిని మెరుగుపరచడంలో మొదటి దశ వివిధ నమూనాల ఆర్‌ఎన్‌ఏ కంటెంట్ చాలా మారుతుందని గ్రహించడం.కాలేయం, క్లోమం, గుండె, మెదడు, పిండం, మూత్రపిండాలు, ఊపిరితిత్తులు, థైమస్, అండాశయం, తక్కువ సమృద్ధి (<0.05ug/mg) mg వంటి కాలేయం, క్లోమం, గుండె, మధ్యస్థ సమృద్ధి (0.05-2ug/mg) వంటి అధిక సమృద్ధి (2-4ug/mg) మూత్రాశయం, ఎముక, కొవ్వు వంటివి.

1: RNని విడుదల చేయడానికి కణాలను లైస్ చేయండి – RNA విడుదల చేయకపోతే, దిగుబడి తగ్గుతుంది.ఎలక్ట్రిక్ హోమోజెనైజేషన్ ఇతర సజాతీయీకరణ పద్ధతుల కంటే మెరుగ్గా పనిచేస్తుంది, అయితే లిక్విడ్ నైట్రోజన్ మాషింగ్, ఎంజైమాటిక్ డైజెషన్ (లైసోజైమ్/లైటికేస్) వంటి ఇతర పద్ధతులతో కూడా కలపాల్సి ఉంటుంది.

2: వెలికితీత పద్ధతి యొక్క ఆప్టిమైజేషన్.ఫినాల్-ఆధారిత పద్ధతులతో ఉన్న అతిపెద్ద సమస్యలు అసంపూర్ణ స్తరీకరణ మరియు పాక్షిక RNA నష్టం (అధికారికాన్ని పూర్తిగా తొలగించడం సాధ్యం కాదు).అధిక న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ మరియు ప్రోటీన్ కంటెంట్ కారణంగా అసంపూర్ణ స్తరీకరణ జరుగుతుంది, ఇది ఉపయోగించిన లైసేట్ మొత్తాన్ని పెంచడం ద్వారా లేదా నమూనా మొత్తాన్ని తగ్గించడం ద్వారా పరిష్కరించబడుతుంది.కొవ్వు కణజాలానికి క్లోరోఫామ్ వెలికితీత యొక్క ఒక దశ జోడించబడింది.ఆర్‌ఎన్‌ఏ నష్టాన్ని బ్యాక్-పంపింగ్ చేయడం ద్వారా లేదా సెంట్రిఫ్యూగేషన్ తర్వాత ఆర్గానిక్ పొరను తొలగించడం ద్వారా తగ్గించవచ్చు.కాలమ్ సెంట్రిఫ్యూగేషన్-ఆధారిత పద్ధతులతో అతిపెద్ద సమస్య అదనపు నమూనా.

క్లాసిక్ సంగ్రహణ చిట్కాలు

1. ఫినాల్ శుద్దీకరణ: 1:1 ఫినాల్/క్లోరోఫామ్ సమానమైన వాల్యూమ్‌ను జోడించి 1-2 నిమిషాల పాటు తీవ్రంగా కలపండి.2 నిమిషాల పాటు అధిక వేగంతో సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయండి.సూపర్నాటెంట్ (80-90%) జాగ్రత్తగా తొలగించండి.మధ్య పొరను ఎప్పుడూ పొందవద్దు.ప్రతిచర్య ద్రావణం యొక్క సమాన పరిమాణాన్ని ఫినాల్/క్లోరోఫామ్‌కు జోడించవచ్చు మరియు సూపర్‌నాటెంట్‌ను తొలగించవచ్చు.దిగుబడిని మెరుగుపరచడానికి న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ అవపాతం కోసం రెండు సూపర్నాటెంట్లను కలపవచ్చు.మిక్సింగ్ చేసేటప్పుడు చాలా సున్నితంగా ఉండకండి మరియు అన్ని సూపర్నాటెంట్లను తొలగించడానికి ప్రయత్నించవద్దు.

2. 70-80% ఇథనాల్‌తో కడగడం: వాషింగ్ సమయంలో, అవశేష ఉప్పు కొట్టుకుపోతుందని నిర్ధారించుకోవడానికి న్యూక్లియిక్ యాసిడ్‌ను సస్పెండ్ చేయాలి.అదే సమయంలో, ఇథనాల్‌ను పోసిన వెంటనే, కొన్ని సెకన్ల పాటు అధిక వేగంతో సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసి, ఆపై పైపెట్‌తో అవశేష ఇథనాల్‌ను తొలగించండి.5-10 నిమిషాలు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద నిలబడి తర్వాత కరిగించండి.

11. ప్రత్యేక సంస్థల వెలికితీత

1. పీచు కణజాలం: గుండె/అస్థిపంజర కండరం వంటి ఫైబరస్ కణజాలం నుండి RNA వెలికితీతకు కీలకం కణజాలాన్ని పూర్తిగా భంగపరచడం.ఈ కణజాలాలు తక్కువ కణ సాంద్రతను కలిగి ఉంటాయి, కాబట్టి కణజాలం యొక్క యూనిట్ బరువుకు RNA మొత్తం తక్కువగా ఉంటుంది మరియు వీలైనంత ఎక్కువ ప్రారంభ మొత్తాన్ని ఉపయోగించడం ఉత్తమం.గడ్డకట్టే పరిస్థితుల్లో పూర్తిగా కణజాలం రుబ్బు అని నిర్ధారించుకోండి.

2. అధిక ప్రొటీన్/ఫ్యాట్ కంటెంట్ ఉన్న కణజాలాలు: మెదడు/వెజిటబుల్ ఫ్యాట్ కంటెంట్ ఎక్కువగా ఉంటుంది.PCI వెలికితీత తర్వాత, సూపర్‌నాటెంట్‌లో తెల్లటి ఫ్లోక్యుల్స్ ఉంటాయి.సూపర్‌నాటెంట్‌ను క్లోరోఫామ్‌తో తిరిగి వెలికితీయాలి.

3. అధిక న్యూక్లియిక్ ఆమ్లం/రైబోజైమ్ కంటెంట్ ఉన్న కణజాలాలు: ప్లీహము/థైమస్ అధిక న్యూక్లియిక్ ఆమ్లం మరియు రైబోజైమ్ కంటెంట్‌ను కలిగి ఉంటాయి.గడ్డకట్టే పరిస్థితులలో కణజాలాన్ని గ్రౌండింగ్ చేయడం ద్వారా వేగంగా సజాతీయీకరణ చేయడం ద్వారా రైబోజైమ్‌లను సమర్థవంతంగా నిష్క్రియం చేయవచ్చు.అయినప్పటికీ, లైసేట్ చాలా జిగటగా ఉంటే (అధిక న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ కంటెంట్ కారణంగా), PCI వెలికితీత ప్రభావవంతంగా స్తరీకరించబడదు;మరింత లైసేట్ జోడించడం ద్వారా ఈ సమస్యను పరిష్కరించవచ్చు.బహుళ PCI వెలికితీతలు మరింత అవశేష DNAని తొలగించగలవు.ఆల్కహాల్ కలిపిన వెంటనే తెల్లటి అవక్షేపం ఏర్పడితే, అది DNA కాలుష్యాన్ని సూచిస్తుంది.కరిగిన తర్వాత ఆమ్ల PCIతో తిరిగి వెలికితీస్తే DNA కాలుష్యాన్ని తొలగించవచ్చు.

4. మొక్కల కణజాలం: జంతు కణజాలం కంటే మొక్కల కణజాలం సంక్లిష్టంగా ఉంటుంది.సాధారణంగా, మొక్కలు ద్రవ నత్రజని పరిస్థితులలో నేలగా ఉంటాయి, కాబట్టి ఎండోజెనస్ ఎంజైమ్‌ల ద్వారా RNA క్షీణత అసాధారణం.క్షీణత సమస్య పరిష్కరించబడకపోతే, ఇది దాదాపుగా నమూనాలో ఉన్న మలినాలను కలిగి ఉంటుంది.అనేక మొక్కలలో ఉన్న మలినాలు అవశేషాలకు దారితీస్తాయి మరియు అవశేషాలకు కారణం తరచుగా ఈ మలినాలు RNAతో కొన్ని సారూప్యతలను కలిగి ఉంటాయి: మీరు అవక్షేపించండి మరియు నేను అవక్షేపించండి మరియు మీరు శోషించండి మరియు నేను శోషించండి.ఈ లక్షణాలు అవి చాలా బలమైన ఎంజైమ్ ఇన్హిబిటర్స్ అని నిర్ణయిస్తాయి.

ప్రస్తుతం, వాణిజ్య RNA వెలికితీత కారకాలు చిన్న సర్దుబాట్లతో దాదాపు అన్ని జంతు కణజాలాలకు అనుగుణంగా ఉంటాయి, అయితే చాలా మొక్కల కణజాలాలకు సరిపోయే కొన్ని వాణిజ్య RNA వెలికితీత కారకాలు ఉన్నాయి.అదృష్టవశాత్తూ, ఫోర్జీన్ ప్రత్యేకతను అందించగలదుమొక్క RNA వెలికితీత కిట్లు, మాకు ఉందిమొక్క మొత్తం RNA ఐసోలేషన్ కిట్, ప్లాంట్ టోటల్ RNA ఐసోలేషన్ కిట్ ప్లస్.తరువాతి ప్రత్యేకంగా అధిక పాలీసాకరైడ్ మరియు పాలీఫెనాల్ కంటెంట్ ఉన్న మొక్కల కోసం రూపొందించబడింది.RNA వెలికితీత కోసం, ల్యాబ్ వినియోగదారుల నుండి అభిప్రాయం చాలా బాగుంది.

12. నమూనా గడ్డకట్టడం మరియు కరిగించడం యొక్క ప్రభావం స్తంభింపచేసిన నమూనా పెద్దదిగా ఉండవచ్చు మరియు RNA వెలికితీత కోసం ఉపయోగించే ముందు దానిని కత్తిరించాల్సిన అవసరం ఉంది.కత్తిరింపు సమయంలో నమూనాలు కరుగుతాయి (బహుశా పాక్షికంగా).RNA వెలికితీతకు ముందు ఘనీభవించిన నమూనాలను తూకం వేయవలసి ఉంటుంది మరియు ఈ ప్రక్రియలో కరిగించడం ఖచ్చితంగా జరుగుతుంది.కొన్నిసార్లు, ద్రవ నత్రజని మిల్లింగ్ ప్రక్రియలో నమూనా యొక్క ద్రవీభవన కూడా సంభవిస్తుంది;లేదా ఘనీభవించిన నమూనా నేరుగా లిక్విడ్ నైట్రోజన్ మిల్లింగ్ లేకుండా లైసేట్‌కు జోడించబడుతుంది మరియు పూర్తి సజాతీయీకరణకు ముందు కరిగించడం ఖచ్చితంగా జరుగుతుంది.తాజా కణజాలం కంటే ఘనీభవించిన కణజాలం ద్రవీభవన సమయంలో RNA క్షీణతకు ఎక్కువ అవకాశం ఉందని ప్రయోగాలు చూపించాయి.సంభావ్య కారణం: ఫ్రీజ్-థా ప్రక్రియ సెల్ లోపల నిర్మాణాలకు అంతరాయం కలిగిస్తుంది, అంతర్జాత ఎంజైమ్‌లు RNAతో ప్రత్యక్ష సంబంధంలోకి రావడాన్ని సులభతరం చేస్తుంది.

13. RNA నాణ్యత యొక్క తీర్పు సాధారణంగా, RNA యొక్క సమగ్రతను నిర్ధారించడానికి ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ఉపయోగించబడుతుంది మరియు RNA యొక్క స్వచ్ఛతను నిర్ధారించడానికి A260/A280 ఉపయోగించబడుతుంది.సిద్ధాంతంలో, చెక్కుచెదరని RNA 28S:18S = 2.7:1 నిష్పత్తిని కలిగి ఉంటుంది మరియు చాలా డేటా 28S:18S = 2:1 నిష్పత్తిని నొక్కి చెబుతుంది.వాస్తవం ఏమిటంటే కణాలు కాకుండా ఇతర నమూనాల నుండి సేకరించిన RNA దాదాపు ఏదీ 2:1 నిష్పత్తిలో లేదు (ఇది ఎజిలెంట్ బయోఅనలైజర్‌ని ఉపయోగించి పొందబడింది).

RNA యొక్క ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ఫలితాలు సెకండరీ స్ట్రక్చర్, ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ పరిస్థితులు, నమూనా లోడ్, EB ద్వారా సంతృప్త స్థాయి మొదలైన అనేక కారకాలచే ప్రభావితమవుతాయి. RNAను గుర్తించడానికి మరియు DNA మార్కర్‌ని నియంత్రణగా ఉపయోగించడానికి స్థానిక ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్‌ని ఉపయోగించండి.2kb వద్ద 28S మరియు 0.9kb వద్ద 18S స్పష్టంగా ఉంటే మరియు 28S: 18S > 1, సమగ్రత చాలా తదుపరి ప్రయోగాల అవసరాలను తీర్చగలదు.

A260/A280 అనేది చాలా గందరగోళానికి కారణమైన సూచిక.అన్నింటిలో మొదటిది, న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల కోసం ఈ సూచిక యొక్క అసలు అర్ధాన్ని స్పష్టం చేయడం అవసరం: స్వచ్ఛమైన RNA, దాని A260/280 = సుమారు 2.0.స్వచ్ఛమైన RNA 'కారణం' మరియు A260/A280 = 2 'ప్రభావం'.ఇప్పుడు అందరూ A260/A280ని 'కారణం'గా ఉపయోగిస్తున్నారు, “A260/A280 = 2 అయితే, RNA స్వచ్ఛమైనది” అని అనుకుంటూ సహజంగానే గందరగోళానికి దారి తీస్తుంది.

మీకు ఆసక్తి ఉన్నట్లయితే, మీరు మీ RNA నమూనాకు ఫినాల్, గ్వానిడైన్ ఐసోథియోసైనేట్, PEG మొదలైన వాటిని వెలికితీసేందుకు తరచుగా ఉపయోగించే కొద్దిగా రియాజెంట్‌ని జోడించవచ్చు, ఆపై A260/A280 నిష్పత్తిని కొలవవచ్చు.వాస్తవం ఏమిటంటే, RNA వెలికితీత కోసం ఉపయోగించే అనేక కారకాలు, అలాగే నమూనాలోని అనేక మలినాలను, A260/A280ని ప్రభావితం చేసే A260 మరియు A280 చుట్టూ గ్రహిస్తాయి.

200-300 nm పరిధిలో RNA నమూనాలను స్కాన్ చేయడం ప్రస్తుతం అత్యంత సూచనాత్మకమైన విధానం.స్వచ్ఛమైన RNA యొక్క వక్రరేఖ క్రింది లక్షణాలను కలిగి ఉంటుంది: వక్రరేఖ మృదువైనది, A230 మరియు A260 రెండు ఇన్‌ఫ్లెక్షన్ పాయింట్‌లు, A300 0కి దగ్గరగా ఉంటుంది, A260/A280 = దాదాపు 2.0, మరియు A260/A230 = దాదాపు 2.0.స్కాన్ డేటా అందుబాటులో లేనట్లయితే, A260/A230 నిష్పత్తిని కూడా నిర్ణయించాలి, ఎందుకంటే ఈ నిష్పత్తి ఎంజైమాటిక్ ప్రతిచర్యను ప్రభావితం చేసే అన్ని మలినాలను తీసుకువెళ్లడానికి మరింత సున్నితంగా ఉంటుంది.పరికరం యొక్క సరళ పరిధిని పరిగణనలోకి తీసుకోండి (A260 కోసం 0.1–0.5).

రెండు ఇతర ఉపయోగకరమైన దృగ్విషయాలు ఉన్నాయి: A260/A280ని నీటిలో కొలిచినప్పుడు నిష్పత్తి 0.3 తక్కువగా ఉంటుంది;అయితే 10 mM EDTAలో కొలవబడిన నిష్పత్తి 1 mM EDTAలో కొలవబడిన దానికంటే దాదాపు 0.2 ఎక్కువ.

సంబంధిత ఉత్పత్తులు:

చైనా ప్లాంట్ మొత్తం RNA ఐసోలేషన్ కిట్ తయారీదారు మరియు సరఫరాదారు |ఫోర్జీన్ (foreivd.com)

RNA ఐసోలేషన్ సిరీస్ సరఫరాదారులు మరియు ఫ్యాక్టరీ |చైనా RNA ఐసోలేషన్ సిరీస్ తయారీదారులు (foreivd.com)

RNA ఐసోలేషన్ సిరీస్ - ఫోర్జీన్ కో., లిమిటెడ్. (foreivd.com)