RT-qPCR ప్రయోగంలో RNA వెలికితీత మరియు నాణ్యత అంచనా, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ మరియు qPCR మూడు దశలు ఉంటాయి, ప్రతి దశకు చాలా జాగ్రత్తలు ఉంటాయి, మేము క్రింద వివరంగా పరిచయం చేస్తాము.

Ⅰ.RNA నాణ్యత అంచనా

RT-qPCR ప్రయోగంలో, RNA వెలికితీత పూర్తయిన తర్వాత, RNA యొక్క నాణ్యతను మూల్యాంకనం చేయాలి మరియు తదుపరి ప్రయోగం అర్హత పొందిన తర్వాత మాత్రమే నిర్వహించబడుతుంది.మూల్యాంకన పద్ధతులలో స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్, ఎజిలెంట్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్, ఎజిలెంట్ 2100 విశ్లేషణ ఉన్నాయి, వీటిలో సాధారణంగా ఉపయోగించే స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ మరియు అగరోస్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ మెథడ్ డిటెక్షన్.RNA ఏకాగ్రత, స్వచ్ఛత మరియు సమగ్రత యొక్క గుర్తింపు మరియు విశ్లేషణను పూర్తి చేయడానికి, RNA నాణ్యతను నిర్ధారించడానికి ఈ రెండు పద్ధతులను కలిపి ఉపయోగించాల్సిన అవసరం ఉందని గమనించాలి.

సంబంధిత RNA ఐసోలేషన్ కిట్: 

సెల్ మొత్తం RNA ఐసోలేషన్ కిట్

అత్యంత శుద్ధి చేయబడిన మరియు అధిక-నాణ్యత కలిగిన మొత్తం RNAను 11 నిమిషాలలో వివిధ కల్చర్డ్ కణాల నుండి పొందవచ్చు.

యానిమల్ టోటల్ RNA ఐసోలేషన్ కిట్

వివిధ జంతు కణజాలాల నుండి అధిక-స్వచ్ఛత మరియు అధిక-నాణ్యత మొత్తం RNAను త్వరగా మరియు సమర్ధవంతంగా సంగ్రహించండి.

స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్:

స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ ప్రధానంగా RNA యొక్క ఏకాగ్రత మరియు స్వచ్ఛతను గుర్తించడానికి ఉపయోగించబడుతుంది, అయితే ఇది RNA మరియు జన్యు అవశేషాల సమగ్రతను గుర్తించలేదు.వాటిలో, A260/280 మరియు A260/230 RNA స్వచ్ఛతను గుర్తించడానికి ముఖ్యమైన పారామితులు, మరియు RNA స్వచ్ఛతను వాటి విలువల హెచ్చుతగ్గుల ప్రకారం గుర్తించవచ్చు:

1. 1.9< A260/280< 2.1, RNA స్వచ్ఛత మంచిదని సూచిస్తుంది;A260/280<1.9, RNAలో ప్రోటీన్ అవశేషాలు ఉండవచ్చని సూచిస్తుంది;A260/280>2.1, RNA యొక్క పాక్షిక క్షీణతను సూచిస్తుంది, ఇది అగరోజ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా మరింత ధృవీకరించబడుతుంది.

2. 2.0< A260/230< 2.2, RNA స్వచ్ఛత మంచిదని సూచిస్తుంది;A260/230< 2.0, RNAలో ఫినాల్స్, ఇథనాల్ లేదా షుగర్స్ వంటి సేంద్రీయ కారకాల అవశేషాలు ఉండవచ్చని సూచిస్తుంది.

అగరోజ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్:

అగరోస్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ అస్సే RNA సమగ్రత, జీనోమ్ మరియు ప్రోటీన్ అవశేషాలను విశ్లేషించగలదు, కానీ RNA యొక్క ఏకాగ్రతను ఖచ్చితంగా లెక్కించదు లేదా సేంద్రీయ కారకాల అవశేషాలను గుర్తించదు.ఉదాహరణకు యూకారియోటిక్ RNA టెంప్లేట్‌లను తీసుకోండి:

1. RNA అగరోజ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్‌కు గురైంది.జెల్ మ్యాప్‌లో 28sRNA, 18sRNA మరియు 5.8sRNA యొక్క మూడు సింగిల్ బ్యాండ్‌లు మాత్రమే ఉన్నట్లయితే, అది సంగ్రహించిన RNA చెక్కుచెదరకుండా ఉందని సూచిస్తుంది.లాగడం దృగ్విషయం ఉంటే, అది RNA యొక్క పాక్షిక క్షీణతను సూచిస్తుంది.

2. జిగురు రంధ్రం మరియు 28sRNA బ్యాండ్ మధ్య ఒకే ప్రకాశవంతమైన బ్యాండ్ ఉంటే, జన్యుసంబంధమైన DNA అవశేషాలు ఉండవచ్చు.

3. గ్లూ రంధ్రంలో బ్యాండ్లు కనిపిస్తే, ప్రోటీన్ మరియు ఇతర స్థూల కణ పదార్ధాల అవశేషాలు ఉండవచ్చని సూచిస్తుంది.

Ⅱ. రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్

RNA వెలికితీత పూర్తయిన తర్వాత, తదుపరి ప్రయోగాల కోసం దానిని cDNAలోకి మార్చాలి, కాబట్టి రివర్సల్ దశ చాలా అవసరం.రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్ మరియు ప్రైమర్ ఎంపిక నుండి రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ పరిచయం చేయబడుతుంది:

రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ ఎంపిక:

సాధారణ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్‌లలో AMV RTase మరియు MMLV RTase ఉన్నాయి.AMV RTase యొక్క RNase H బలమైన కార్యాచరణ, తక్కువ సంశ్లేషణ పొడవు, తక్కువ సంశ్లేషణ మొత్తం మరియు మంచి ఉష్ణ స్థిరత్వం (42 ~ 55℃) కలిగి ఉంది.MMLV RTase యొక్క RNase H కార్యాచరణ బలహీనంగా ఉంది, సంశ్లేషణ పొడవు పొడవుగా ఉంది, సంశ్లేషణ మొత్తం ఎక్కువగా ఉంటుంది మరియు ఉష్ణ స్థిరత్వం తక్కువగా ఉంది (37 ~ 42℃).

RNase H ఎంజైమ్ RNA టెంప్లేట్‌ను దిగజార్చడం యొక్క పనితీరును కలిగి ఉన్నందున, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సమయంలో బలహీనమైన RNase H కార్యాచరణతో కూడిన MMLVని ప్రాధాన్యతగా ఎంచుకోవాలి మరియు తరువాత జన్యు ఇంజనీరింగ్ తర్వాత, MMLV యొక్క ఉష్ణ స్థిరత్వం ఒక గుణాత్మక ఎత్తుకు చేరుకుంది.ఫోర్జీన్ తీసుకోవడంఫోర్సీ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ (రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కోసం M-MLV) ఉదాహరణగా, ఇది జెనెటిక్ రీకాంబినేషన్ టెక్నాలజీని ఉపయోగించి E. కోలి ఇంజనీరింగ్ బ్యాక్టీరియాలో వ్యక్తీకరించబడిన కొత్త రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్.ఇది రీకాంబినెంట్ DNA పాలిమరేస్, ఇది సింగిల్-స్ట్రాండ్డ్ RNA, DNA లేదా RNA:DNA హైబ్రిడ్ నుండి కాంప్లిమెంటరీ DNA స్ట్రాండ్‌ను సంశ్లేషణ చేస్తుంది.దీనికి RNase H కార్యాచరణ, బలమైన స్థిరత్వం, బలమైన RNA అనుబంధం మరియు అధిక గుర్తింపు సున్నితత్వం లేదు.

 

ఫోర్సీ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ (రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కోసం M-MLV)

ప్రైమర్ ఎంపిక:

సాధారణంగా RT ప్రైమర్‌లు మూడు వర్గాలలోకి వస్తాయి: ఒలిగో dT, రాండమ్ ప్రైమర్‌లు మరియు జన్యు-నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌లు.విభిన్న ప్రయోగాత్మక అవసరాలకు అనుగుణంగా ఉపయోగించడానికి తగిన ప్రైమర్‌లను ఎంచుకోండి.

1. టెంప్లేట్ యూకారియోటిక్ మూలం మరియు చివరి cDNA సాధారణ PCR యాంప్లిఫికేషన్ కోసం ఉపయోగించబడితే, Oligo (dT) సిఫార్సు చేయబడింది;తదుపరి ప్రయోగం qPCR కోసం మాత్రమే ఉపయోగించబడితే, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సామర్థ్యాన్ని మెరుగుపరచడానికి ఒలిగో (dT)ని యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్‌లతో కలపాలని సిఫార్సు చేయబడింది.

2. టెంప్లేట్ ప్రొకార్యోట్‌ల నుండి వచ్చినట్లయితే, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కోసం రాండమ్ ప్రైమర్‌లు లేదా జీన్ స్పెసిఫిక్ ప్రైమర్‌లను ఎంచుకోవాలి.

Ⅲ.qPCR

ఫ్లోరోసెన్స్ క్వాంటిఫికేషన్ ప్రధానంగా పరిమాణాత్మక పద్ధతుల ఎంపిక, ప్రైమర్ డిజైన్ సూత్రాలు, ROX ఎంపిక, ప్రతిచర్య వ్యవస్థ కాన్ఫిగరేషన్ మరియు ప్రతిచర్య పరిస్థితుల సెట్టింగ్ మొదలైన వాటి నుండి వివరించబడింది.

పరిమాణాత్మక పద్ధతుల ఎంపిక:

పరిమాణాత్మక పద్ధతులు సాపేక్ష పరిమాణాత్మక పద్ధతులు మరియు సంపూర్ణ పరిమాణాత్మక పద్ధతులుగా విభజించబడ్డాయి.జన్యు వ్యక్తీకరణపై నిర్దిష్ట చికిత్సా పద్ధతుల ప్రభావాన్ని గుర్తించడానికి, వివిధ సమయాల్లో జన్యు వ్యక్తీకరణ యొక్క వ్యత్యాసాన్ని గుర్తించడానికి మరియు వివిధ కణజాలాలలో జన్యు వ్యక్తీకరణ యొక్క వ్యత్యాసాన్ని పోల్చడానికి సాపేక్ష పరిమాణీకరణను ఉపయోగించవచ్చు.సంపూర్ణ పరిమాణీకరణ వైరస్‌లోని న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ మొత్తాన్ని గుర్తించగలదు మరియు మొదలైనవి.ప్రయోగాలు చేసేటప్పుడు, మన స్వంత ప్రయోగాల ప్రకారం తగిన పరిమాణాత్మక పద్ధతులను ఎంచుకోవాలి.

ప్రైమర్ డిజైన్ సూత్రాలు:

qPCR కోసం ప్రైమర్ రూపకల్పన నేరుగా విస్తరణ సామర్థ్యం మరియు ఉత్పత్తి విశిష్టతకు సంబంధించినది.అందువల్ల, మంచి ప్రైమర్‌లను సరిగ్గా రూపొందించడం విజయవంతమైన qPCR యొక్క మొదటి దశ.ప్రైమర్ రూపకల్పనలో, సాంప్రదాయ ప్రైమర్ డిజైన్ సూత్రానికి అనుగుణంగా ఈ క్రింది సూత్రాలకు శ్రద్ధ వహించాలి:

1. లక్ష్య భాగం యొక్క పొడవు 100 మరియు 300 bp మధ్య నియంత్రించబడుతుంది;

2. జన్యుసంబంధమైన DNA ప్రభావాన్ని నివారించడానికి క్రాస్-ఎక్సాన్ డిజైన్;

3. డిజైన్ చేయబడిన ప్రైమర్‌లను యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం కోసం పరీక్షించాల్సిన అవసరం ఉంది మరియు యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం ప్రమాణానికి (90-110%) చేరుకున్నప్పుడు మాత్రమే వాటిని పరిమాణాత్మక ప్రయోగాలకు ఉపయోగించవచ్చు;

4. ప్రైమర్ ఏకాగ్రత సాధారణంగా 0.1uM మరియు 1.0uM మధ్య ఆప్టిమైజ్ చేయబడుతుంది.

యొక్క ఎంపికROX:

పరిమాణాత్మక ప్రతిచర్య ప్రక్రియలో, ROX ఆప్టికల్ పాత్ తేడా, పైపెట్టింగ్ లోపం లేదా బాష్పీభవనం మరియు సంక్షేపణం కారణంగా ఏర్పడే వాల్యూమ్ వ్యత్యాసాన్ని ఏకరీతిగా సర్దుబాటు చేయగలదు, ఫలితాల పునరావృతతను మెరుగుపరుస్తుంది.అయితే, ROX యొక్క ఎంపిక సాధనానికి సంబంధించినదని గమనించాలి.qPCR పరికరం రంధ్రాల మధ్య వ్యత్యాసాన్ని స్వయంచాలకంగా సరిచేసే పనిని కలిగి ఉంటే, అది ROXని జోడించాల్సిన అవసరం లేదు;లేకుంటే, అది ROX దిద్దుబాటును జోడించాలి.రియాజెంట్‌లను కొనుగోలు చేయడంలో చిన్న భాగస్వాములు సరైన ROXని ఎంచుకోవడానికి ఉపయోగించే పరికరం ప్రకారం ఉండాలి, తర్వాత తప్పులను నివారించండి.

ప్రతిచర్య వ్యవస్థ తయారీ:

20ul మరియు 50ul ప్రతిచర్య వాల్యూమ్‌లకు ప్రాధాన్యత ఇవ్వబడుతుంది.వ్యవస్థను రూపొందించినప్పుడు ఈ క్రింది అంశాలకు శ్రద్ధ వహించాలి:

1. అల్ట్రా-క్లీన్ వర్క్‌బెంచ్, కొత్త ddHలో వెంటిలేషన్ ద్వారా ప్రతిచర్య వ్యవస్థను సిద్ధం చేయాలి₂ప్రతి ప్రయోగానికి O ఉపయోగించబడుతుంది;

2. సిస్టమ్‌లో కాలుష్యం ఉందో లేదో ధృవీకరించడానికి ప్రతి ప్రయోగానికి NTCని సిద్ధం చేయాలి మరియు సిస్టమ్‌ను సిద్ధం చేసేటప్పుడు ప్రతి జత ప్రైమర్‌లు NTC చేయాలి;

3. RNA టెంప్లేట్‌లో gDNA అవశేషాలు ఉందో లేదో గుర్తించడానికి, గుర్తింపు కోసం ప్రతి నమూనా కోసం NRTని సిద్ధం చేయవచ్చు;

4. వ్యవస్థను సిద్ధం చేస్తున్నప్పుడు, ఒక నమూనా కోసం కనీసం 3 సాంకేతిక పునరావృత్తులు చేయాలని సిఫార్సు చేయబడింది;

5. టెంప్లేట్ cDNA అయినప్పుడు, qPCR ప్రయోగంపై రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సిస్టమ్ యొక్క నిరోధక ప్రభావాన్ని తగ్గించడానికి 5-10 సార్లు పలుచన చేయాలని సిఫార్సు చేయబడింది.టెంప్లేట్ పరిమాణాన్ని గ్రేడియంట్ ద్వారా అన్వేషించడం ఉత్తమం, తద్వారా CT విలువ 20-30 మధ్య పడిపోతుంది;

6. అవసరమైన ప్రతిచర్యల సంఖ్యను నిర్ణయించండి, ప్రతిచర్యల సంఖ్య ఆధారంగా 5-10% పెంచండి మరియు వాల్యూమ్ కాన్ఫిగరేషన్ సంఖ్యను లెక్కించండి;

7, సిస్టమ్ ప్రీమిక్స్ సూత్రాన్ని ఉపయోగించి తయారు చేయబడింది, సెంట్రిఫ్యూగేషన్ తర్వాత కలపడం మరియు బుడగలు లేకుండా చూసుకోవాలి;

8, వీలైనంత వరకు సహాయక వినియోగ వస్తువులను ఎంచుకోవాలి.

సంబంధిత RT-qPCR కిట్