గుర్తింపు యొక్క విశిష్టత

చాలా సందర్భాలలో, ప్రైమర్ డిజైన్ యొక్క ఉద్దేశ్యం PCR యొక్క ప్రత్యేకతను పెంచడం.ఇది అనేక వేరియబుల్స్ యొక్క ఎక్కువ లేదా తక్కువ ఊహాజనిత ప్రభావం ద్వారా నిర్ణయించబడుతుంది.ఒక ముఖ్యమైన వేరియబుల్ ప్రైమర్ యొక్క 3′ ముగింపులో ఉన్న క్రమం.

ముఖ్యంగా, నిర్దిష్టత కోసం రూపొందించబడిన PCR పరీక్షలు విస్తృత డైనమిక్ పరిధిలో అధిక సామర్థ్యాన్ని కొనసాగించే అవకాశం ఉంది, ఎందుకంటే పరీక్ష నిర్దిష్ట-కాని యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తులను ఉత్పత్తి చేయదు, తద్వారా PCR కారకాలతో పోటీపడుతుంది లేదా ప్రధాన యాంప్లిఫికేషన్ ప్రతిచర్యను నిరోధిస్తుంది.

వాస్తవానికి, కొన్ని సందర్భాల్లో, నిర్దిష్టత చాలా ముఖ్యమైనది కాదు, ఉదాహరణకు, లక్ష్యం దగ్గరి సంబంధాన్ని లెక్కించడం అయితే విభిన్న రోగకారకాలను, ప్రత్యేక డిజైన్, ఆప్టిమైజేషన్ మరియు ధృవీకరణ ప్రమాణాలు అవసరం.

మెల్టింగ్ కర్వ్ అనేది యాంప్లికాన్‌ల విశిష్టతను అంచనా వేయడానికి ఒక ప్రామాణిక పద్ధతి, కనీసం ఒకే లక్ష్యాన్ని విస్తరించాలా వద్దా అనే విషయంలో.అయినప్పటికీ, ద్రవీభవన వక్రతలు తప్పుదారి పట్టించవచ్చని నొక్కి చెప్పాలి, ఎందుకంటే ఉదాహరణకు, సబ్‌ప్టిమల్ ప్రైమర్‌లు మరియు తక్కువ టెంప్లేట్ సాంద్రతల మిశ్రమ ప్రభావాల ద్వారా అవి ప్రభావితమవుతాయి.

P5 |ద్రవీభవన వక్రరేఖ రెండు లక్ష్య DNAల యొక్క విభిన్న మొత్తాలను గుర్తించే రెండు డిటెక్షన్‌ల నుండి పొందిన Tm షిఫ్ట్‌లను చూపుతుంది.

ఎ. అధిక సాంద్రతలలో (ప్రకటన)), qPCR కొలత పూర్తయిన తర్వాత స్పష్టమైన ప్రైమర్ డైమర్ ఉండదు.టెంప్లేట్ ఏకాగ్రత 50 కాపీలు (e)కి తగ్గడంతో, నిర్దిష్ట-కాని ఉత్పత్తి కనిపించడం ప్రారంభమవుతుంది మరియు అత్యల్ప సాంద్రత (f) వద్ద ఉన్న ఏకైక ఉత్పత్తి అవుతుంది.

B. పరీక్ష అన్ని లక్ష్య సాంద్రతలలో ఒకే Tmsను నమోదు చేసింది మరియు అత్యల్ప ఏకాగ్రత (5 కాపీలు) వద్ద కూడా స్పష్టమైన ప్రైమర్ డైమర్ లేదు.ఈ రెండు గుర్తింపు పద్ధతులను ఉపయోగిస్తున్నప్పుడు, NTCలలో ఏ యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తులు కనుగొనబడలేదు.

P5 వివిధ సాంద్రతలలో టెంప్లేట్ ఉన్న నమూనాలతో పొందిన రద్దు వక్రతలను చూపుతుంది.P 5a రెండు అత్యల్ప సాంద్రతలలో, ఉత్పత్తి చేయబడిన నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తుల యొక్క Tms నిర్దిష్ట యాంప్లికాన్‌ల కంటే తక్కువగా ఉన్నాయని చూపిస్తుంది.

సహజంగానే, తక్కువ సాంద్రతలలో ఉన్న లక్ష్యాలను గుర్తించడానికి ఈ గుర్తింపు పద్ధతి విశ్వసనీయంగా ఉపయోగించబడదు.

ఆసక్తికరంగా, NTCలు, అంటే, DNA లేని నమూనాలు, (నాన్-స్పెసిఫిక్) యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తులను రికార్డ్ చేయలేదు, ఇది బ్యాక్‌గ్రౌండ్ జెనోమిక్ DNA నిర్దిష్ట-కాని యాంప్లిఫికేషన్/పాలిమరైజేషన్‌లో పాల్గొనవచ్చని సూచిస్తుంది.

కొన్నిసార్లు ఇటువంటి బ్యాక్‌గ్రౌండ్ ప్రైమర్‌లు మరియు నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ పరిష్కరించబడవు, అయితే ఏదైనా టెంప్లేట్ ఏకాగ్రత మరియు NTC (P 5b)లో నిర్దిష్ట-కాని యాంప్లిఫికేషన్ లేని గుర్తింపు పద్ధతిని రూపొందించడం తరచుగా సాధ్యమవుతుంది.

ఇక్కడ, లక్ష్య ఏకాగ్రత యొక్క విస్తరణను 35 Cqతో రికార్డ్ చేయడం కూడా నిర్దిష్ట రద్దు వక్రతను ఉత్పత్తి చేస్తుంది.అదేవిధంగా, NTCలు నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ యొక్క సంకేతాలను చూపించలేదు.కొన్నిసార్లు, గుర్తించే ప్రవర్తన మదర్ లిక్కర్‌పై ఆధారపడి ఉండవచ్చు మరియు నిర్దిష్ట బఫర్ కంపోజిషన్‌లలో నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ మాత్రమే కనుగొనబడుతుంది, ఇది వేర్వేరు Mg2+ సాంద్రతలకు సంబంధించినది కావచ్చు.

గుర్తింపు యొక్క స్థిరత్వం

Ta యొక్క ఆప్టిమైజేషన్ అనేది qPCR గుర్తింపు యొక్క అనుభావిక ధృవీకరణ మరియు ఆప్టిమైజేషన్ ప్రక్రియలో ఉపయోగకరమైన దశ.ఇది NTCని విస్తరించకుండానే అత్యల్ప Cqని ఉత్పత్తి చేసే ఉష్ణోగ్రత (లేదా ఉష్ణోగ్రత పరిధి)ని చూపడం ద్వారా ప్రైమర్ సెట్ యొక్క దృఢత్వం యొక్క ప్రత్యక్ష సూచనను అందిస్తుంది.

అధిక mRNA వ్యక్తీకరణ ఉన్న వ్యక్తులకు సున్నితత్వంలో రెండు నుండి నాలుగు రెట్లు వ్యత్యాసం ముఖ్యమైనది కాకపోవచ్చు, కానీ రోగనిర్ధారణ పరీక్షల కోసం, ఇది సానుకూల మరియు తప్పుడు ప్రతికూల ఫలితాల మధ్య వ్యత్యాసాన్ని సూచిస్తుంది.

qPCR ప్రైమర్‌ల యొక్క Ta లక్షణాలు చాలా మారవచ్చు.కొన్ని పరీక్షలు చాలా పటిష్టంగా లేవు మరియు అవి ప్రైమర్‌ల యొక్క సరైన Ta విలువ కింద నిర్వహించబడకపోతే, అవి త్వరగా కూలిపోతాయి.

ఇది చాలా ముఖ్యం ఎందుకంటే ఈ రకమైన గుర్తింపు వాస్తవ ప్రపంచంలో తరచుగా సమస్యాత్మకంగా ఉంటుంది మరియు నమూనా యొక్క స్వచ్ఛత, DNA యొక్క ఏకాగ్రత లేదా ఇతర DNA యొక్క ఉనికి సరైనది కాకపోవచ్చు.

అదనంగా, లక్ష్య కాపీ సంఖ్య విస్తృత పరిధిలో మారవచ్చు మరియు రియాజెంట్‌లు, ప్లాస్టిక్ పాత్రలు లేదా సాధనాలు పరీక్షను సెటప్ చేసేటప్పుడు ఉపయోగించే వాటికి భిన్నంగా ఉండవచ్చు.

P6|ఉష్ణోగ్రత ప్రవణత PCR గుర్తింపు యొక్క విభిన్న దృఢత్వాన్ని చూపుతుంది.

A. మానవ మెదడు RNA నుండి తయారు చేయబడిన cDNAపై PCR నిర్వహించడానికి బయోలిన్ యొక్క సెన్సిఫాస్ట్ SYBR మాస్టర్‌మిక్స్ (కేటలాగ్ నంబర్ BIO-98050) ఉపయోగించండి.

బి. అపాలీన్ (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG) యొక్క యాంప్లిఫికేషన్ మ్యాప్ మరియు డిసోల్యూషన్ కర్వ్‌ను రికార్డ్ చేయడానికి బయో-రాడ్ యొక్క CFX qPCR పరికరాన్ని ఉపయోగించండి.

C. ACSBG1 యొక్క యాంప్లిఫికేషన్ గ్రాఫ్ మరియు మెల్టింగ్ కర్వ్ (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

D. GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACTCTCCTCCTCGTGGATCTTC) యొక్క యాంప్లిఫికేషన్ గ్రాఫ్ మరియు డిసోల్యూషన్ కర్వ్.

E. Cqలు వేర్వేరు ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతల వద్ద నమోదు చేయబడ్డాయి, 7C ఉష్ణోగ్రత ప్రవణత క్రింద నమోదు చేయబడిన Cqలో తేడాను చూపుతుంది.

P 6 అవాంఛనీయ పరీక్ష యొక్క సాధారణ ఫలితాన్ని చూపుతుంది, ఇక్కడ qPCR 59C మరియు 67C (P 6a) మధ్య గ్రేడియంట్ టాస్‌ని ఉపయోగించి మూడు మానవ మెదడు-నిర్దిష్ట జన్యువులకు ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి నిర్వహించబడింది.

ఒపలిన్ ప్రైమర్‌లు ఆదర్శానికి దూరంగా ఉన్నాయని యాంప్లిఫికేషన్ గ్రాఫ్ నుండి చూడవచ్చు ఎందుకంటే వాటి సరైన Ta పరిధి చాలా ఇరుకైనది (Figure 6b), అంటే Cqలు విస్తృతంగా చెదరగొట్టబడతాయి, ఫలితంగా Cqs వాటి సరైన Cqs తక్కువతో పోల్చబడతాయి.

ఈ గుర్తింపు పద్ధతి అస్థిరంగా ఉంటుంది మరియు సబ్‌ప్టిమల్ యాంప్లిఫికేషన్‌కు దారితీయవచ్చు.కాబట్టి, ఈ జంట ప్రైమర్‌లను పునఃరూపకల్పన చేయాలి.అదనంగా, మెల్టింగ్ కర్వ్ విశ్లేషణ (ఇన్సెట్) ఈ గుర్తింపు పద్ధతి యొక్క విశిష్టత కూడా సమస్యాత్మకంగా ఉండవచ్చని చూపిస్తుంది, ఎందుకంటే ప్రతి Ta యొక్క ద్రవీభవన వక్రరేఖ భిన్నంగా ఉంటుంది.

P 6cలో చూపిన ACSBG1 డిటెక్షన్ మెథడ్ పైన ఉన్న ఒపలిన్ డిటెక్షన్ మెథడ్ కంటే మరింత పటిష్టంగా ఉంది, అయితే ఇది ఇప్పటికీ ఆదర్శానికి దూరంగా ఉంది మరియు దీనిని మెరుగుపరచడానికి అవకాశం ఉంది.

అయినప్పటికీ, దృఢత్వం మరియు నిర్దిష్టత మధ్య అవసరమైన సంబంధం లేదని మేము నొక్కిచెబుతున్నాము, ఎందుకంటే ఈ గుర్తింపు పద్ధతి ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన డిసోల్యూషన్ కర్వ్ అన్ని టాస్ (ఇన్సెట్)లో ఒకే గరిష్ట విలువను చూపుతుంది.

మరోవైపు, P 6dలో చూపిన GFAP పరీక్షలో వలె, పటిష్టత పరీక్ష చాలా సహనంతో ఉంటుంది, టాస్ యొక్క విస్తృత శ్రేణిలో ఇలాంటి Cqలను ఉత్పత్తి చేస్తుంది.

అదే 8 డిగ్రీల సెల్సియస్ పరిధిలో పొందిన Cqsలో వ్యత్యాసం 1 కంటే తక్కువగా ఉంటుంది మరియు డిసోల్యూషన్ కర్వ్ (ఇన్సెట్) ఈ ఉష్ణోగ్రత పరిధిలో గుర్తించే లక్షణాలను నిర్ధారిస్తుంది.లెక్కించబడిన Tas మరియు వాస్తవ Ta పరిధి చాలా భిన్నంగా ఉండవచ్చని గమనించాలి.

పరిశోధకులకు సమర్థవంతమైన ప్రైమర్‌లను రూపొందించడంలో సహాయపడటానికి అనేక మార్గదర్శకాలు రూపొందించబడ్డాయి, వీటిలో ఎక్కువ భాగం దీర్ఘకాలంగా స్థిరపడిన నియమాలపై ఆధారపడి ఉంటాయి మరియు ప్రైమర్‌ల 3′ ముగింపుపై చాలా శ్రద్ధ చూపబడింది.3' చివరలో G లేదా C మరియు రెండు G లేదా C బేస్‌లు (GC క్లాంప్) చేర్చాలని తరచుగా సిఫార్సు చేయబడింది, కానీ చివరి 5 బేస్‌లలో రెండు కంటే ఎక్కువ ఉండకూడదు.

ఆచరణలో, ఈ నియమాలు పరిశోధకులకు మార్గనిర్దేశం చేయగలవు, కానీ అవి అన్ని పరిస్థితులలోనూ సరైనవి కావు.

P7 |ప్రైమర్ యొక్క 3′ ముగింపు నిర్దిష్టత లేదా సామర్థ్యంపై తక్కువ ప్రభావం చూపుతుంది.

A. మానవ HIF-1α (NM_181054.2) జన్యువు కోసం ప్రైమర్‌ల స్థానం.

బి. ఆరు పరీక్ష అంశాలను విస్తరించడానికి ఎజిలెంట్ బ్రిలియంట్ III SYBR గ్రీన్ మదర్ లిక్కర్ (క్యాట్. నం. 600882) ఉపయోగించండి.

C. బయో-రాడ్ యొక్క CFX qPCR పరికరం మరియు 3′ఎండ్ ప్రైమర్‌ల ద్వారా యాంప్లిఫికేషన్ గ్రాఫ్ మరియు మెల్టింగ్ కర్వ్ రికార్డ్ చేయబడింది.NTCలు ఎరుపు రంగులో చూపబడ్డాయి.

D. ప్రతి పరీక్ష అంశం యొక్క Cqs రికార్డు

ఉదాహరణకు, P 7లో ఫలితం 3′end నియమానికి విరుద్ధంగా ఉంది.NTCలో నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్‌కు దారితీసే రెండు ప్రైమర్ కాంబినేషన్‌తో అన్ని డిజైన్‌లు ప్రాథమికంగా ఒకే ఫలితాలను అందిస్తాయి.

అయినప్పటికీ, మేము GC క్లిప్ యొక్క ప్రభావానికి మద్దతు ఇవ్వలేము, ఎందుకంటే ఈ సందర్భంలో, A లేదా Tని గరిష్టంగా 30 బేస్‌లుగా ఉపయోగించడం నిర్దిష్టతను తగ్గించదు.

టెస్ట్ C, ఇక్కడ F ప్రైమర్ GGCCలో ముగుస్తుంది, NTCలలో Cqలను రికార్డ్ చేసింది, ఇది 30-ఎండ్‌లో ఈ సీక్వెన్స్‌లను నివారించాలనుకోవచ్చని సూచిస్తుంది.ప్రైమర్ పెయిర్ యొక్క ఉత్తమ 3′ఎండ్ సీక్వెన్స్‌ను గుర్తించడానికి ఏకైక మార్గం కొంతమంది అభ్యర్థి ప్రైమర్‌లను ప్రయోగాత్మకంగా మూల్యాంకనం చేయడం అని మేము నొక్కిచెబుతున్నాము.

యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం

ముఖ్యంగా, నాన్-స్పెసిఫిక్ PCR డిటెక్షన్ ఎప్పటికీ నిర్దిష్టం కానప్పటికీ, ఎంజైమ్, మదర్ లిక్కర్, సంకలనాలు మరియు సైక్లింగ్ పరిస్థితులను మార్చడం ద్వారా యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని అనేక రకాలుగా సర్దుబాటు చేయవచ్చు మరియు గరిష్టీకరించవచ్చు.

PCR గుర్తింపు యొక్క సామర్థ్యాన్ని అంచనా వేయడానికి, లక్ష్య న్యూక్లియిక్ ఆమ్లం కంటే 10 లేదా 5 రెట్లు సీరియల్ పలుచనను ఉపయోగించడం ఉత్తమం, అంటే "ప్రామాణిక వక్రత పద్ధతి".

PCR యాంప్లికాన్‌లు లేదా సింథటిక్ DNA లక్ష్యాలను ప్రామాణిక వక్రరేఖను రూపొందించడానికి ఉపయోగించినట్లయితే, ఈ లక్ష్యాల యొక్క సీరియల్ డైల్యూషన్‌లు స్థిరమైన నేపథ్య DNA (జెనోమిక్ DNA వంటివి)తో కలపాలి.

P8 |PCR యొక్క సామర్థ్యాన్ని అంచనా వేయడానికి పలుచన వక్రరేఖ.

A. PCR మరియు మెల్టింగ్ కర్వ్ పరిస్థితుల కోసం HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA మరియు R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC మరియు ఎజిలెంట్స్ బ్రిలియంట్ III SYBR గ్రీన్ మాస్టర్‌మిక్స్ (కేటలాగ్ నంబర్ 600882) కోసం ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించండి.

B. 100 ng RNA రివర్స్ లిప్యంతరీకరణ చేయబడింది, 2 సార్లు పలుచన చేయబడింది మరియు సీరియల్‌గా పలుచన చేయబడిన cDNA నమూనాలు 1 ng మానవ జన్యుసంబంధమైన DNAకి 5 సార్లు కరిగించబడ్డాయి.ద్రవీభవన వక్రత ఇన్సెట్‌లో చూపబడింది.

C. రెండవ cDNA నమూనా కోసం RT ప్రతిచర్య, పలుచన మరియు సీరియల్ పలుచన పునరావృతం చేయబడ్డాయి మరియు ఫలితాలు సారూప్యంగా ఉన్నాయి.

P 8 రెండు ప్రామాణిక వక్రతలను చూపుతుంది, రెండు వేర్వేరు cDNA నమూనాలపై ఒకే గుర్తింపు పద్ధతిని ఉపయోగిస్తుంది, ఫలితం అదే సామర్థ్యం, ​​దాదాపు 100%, మరియు R2 విలువ కూడా సమానంగా ఉంటుంది, అంటే ప్రయోగాత్మక డేటా మరియు రిగ్రెషన్ లైన్ లేదా డేటా డిగ్రీ మధ్య సరిపోయే స్థాయి.

రెండు ప్రామాణిక వక్రతలు పోల్చదగినవి, కానీ సరిగ్గా ఒకేలా ఉండవు.లక్ష్యాన్ని ఖచ్చితంగా లెక్కించడమే లక్ష్యం అయితే, అనిశ్చితిని వివరించకుండా కాపీ సంఖ్య గణనను అందించడం ఆమోదయోగ్యం కాదని గమనించాలి.

P9 |ప్రామాణిక వక్రరేఖను ఉపయోగించి పరిమాణీకరణతో అనుబంధించబడిన కొలత అనిశ్చితి.

ఎ. PCR మరియు మెల్టింగ్ కర్వ్ పరిస్థితులను నిర్వహించడానికి GAPDH (NM_002046) కోసం ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించండి.F: ACAGTTGCCATGTAGACC మరియు R: TAACTGGTTGAGCACAGG మరియు బయోలైన్ యొక్క సెన్సిఫాస్ట్ SYBR మాస్టర్‌మిక్స్ (కేటలాగ్ నంబర్ BIO-98050).

B. బయో-రాడ్ యొక్క CFX qPCR పరికరంతో రికార్డ్ చేయబడిన యాంప్లిఫికేషన్ చార్ట్, మెల్టింగ్ కర్వ్ మరియు స్టాండర్డ్ కర్వ్.

C. స్టాండర్డ్ కర్వ్ గ్రాఫ్ మరియు 95% కాన్ఫిడెన్స్ ఇంటర్వెల్ (CI).

D. డైల్యూషన్ కర్వ్ నుండి తీసుకోబడిన మూడు Cq విలువల కాపీ సంఖ్య మరియు 95% విశ్వాస విరామం.

P 9 ఒక ఆప్టిమైజ్ చేసిన పరీక్ష కోసం, ఒకే ప్రామాణిక వక్రరేఖ యొక్క స్వాభావిక వైవిధ్యం సుమారుగా 2 రెట్లు (95% విశ్వాస విరామం, కనిష్ట నుండి గరిష్టంగా) ఉంటుందని చూపిస్తుంది, ఇది ఊహించగల అతి చిన్న వైవిధ్యం కావచ్చు.

సంబంధిత ఉత్పత్తి:

సెల్ డైరెక్ట్ RT qPCR కిట్

మౌస్ టెయిల్ డైరెక్ట్ PCR కిట్

యానిమల్ టిష్యూ డైరెక్ట్ PCR కిట్