qPCR ప్రయోగాలలో, ప్రైమర్ డిజైన్ కూడా చాలా ముఖ్యమైన లింక్.ప్రైమర్‌లు సరిపోతాయా లేదా అనేది యాంప్లిఫికేషన్ ఎఫిషియెన్సీ స్టాండర్డ్‌కు చేరుకుంటుందా, యాంప్లిఫైడ్ ఉత్పత్తులు నిర్దిష్టంగా ఉన్నాయా మరియు ప్రయోగాత్మక ఫలితాలు అందుబాటులో ఉన్నాయా లేదా అనేదానికి దగ్గరి సంబంధం కలిగి ఉంటుంది.
కాబట్టి qPCR ప్రైమర్ స్పెసిసిటీని మెరుగ్గా చేయడం ఎలా?అధిక యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం?
ఈ రోజు, మేము మిమ్మల్ని కలిసి qPCR ప్రైమర్‌లను రూపొందించడానికి తీసుకెళ్తాము మరియు qPCR ప్రైమర్ డిజైన్‌ను ప్రయోగాలలో సమర్థవంతమైన లోర్ నైపుణ్యంగా మారుస్తాము.
qPCR ప్రైమర్‌లను రూపొందించేటప్పుడు, సాధారణంగా ఈ క్రింది అంశాలకు శ్రద్ధ వహించండి: ప్రైమర్‌లను వీలైనంత వరకు ఇంట్రాన్‌లలో డిజైన్ చేయాలి, ఉత్పత్తి పొడవు 100-300 bp ఉండాలి, Tm విలువ 60°Cకి వీలైనంత దగ్గరగా ఉండాలి మరియు అప్‌స్ట్రీమ్ మరియు డౌన్‌స్ట్రీమ్ ప్రైమర్‌లు వీలైనంత దగ్గరగా ఉండాలి మరియు ప్రైమర్ ముగింపు G లేదా C, మొదలైనవి ఉండాలి.
1. ఇంట్రాన్‌లను విస్తరించి ఉన్న ప్రైమర్‌ల రూపకల్పన
qPCR ప్రైమర్‌లను రూపొందిస్తున్నప్పుడు, ఇంట్రాన్‌ల అంతటా రూపొందించబడిన ప్రైమర్‌లను ఎంచుకోవడం gDNA టెంప్లేట్‌ను విస్తరించకుండా నిరోధించవచ్చు మరియు ఉత్పత్తులు అన్నీ cDNA యొక్క విస్తరణ నుండి తీసుకోబడ్డాయి, తద్వారా gDNA కాలుష్యం యొక్క ప్రభావాన్ని తొలగిస్తుంది.
2. ప్రైమర్ పొడవు
ప్రైమర్ పొడవు సాధారణంగా 18-30 nt మధ్య ఉంటుంది మరియు యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తి యొక్క పొడవు వీలైనంత వరకు 100-300 bp మధ్య నియంత్రించబడాలి.
ప్రైమర్ చాలా తక్కువగా ఉంటే, అది నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్‌కు దారి తీస్తుంది మరియు అది చాలా పొడవుగా ఉంటే, అది సులభంగా ద్వితీయ నిర్మాణాన్ని (హెయిర్‌పిన్ నిర్మాణం వంటివి) ఏర్పరుస్తుంది.యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తి చాలా పొడవుగా ఉంటే, అది పాలిమరేస్ యొక్క ప్రతిచర్యకు తగినది కాదు, ఇది PCR యాంప్లిఫికేషన్ యొక్క సామర్థ్యాన్ని ప్రభావితం చేస్తుంది.
3. GC కంటెంట్ మరియు Tm విలువ
ప్రైమర్‌ల యొక్క GC కంటెంట్ 40% మరియు 60% మధ్య నియంత్రించబడాలి.ఇది చాలా ఎక్కువ లేదా చాలా తక్కువగా ఉంటే, అది ప్రతిచర్యను ప్రారంభించడానికి అనుకూలమైనది కాదు.ఒకే Tm విలువను మరియు ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను పొందేందుకు ఫార్వర్డ్ మరియు రివర్స్ ప్రైమర్‌ల యొక్క GC కంటెంట్ అదే దగ్గరగా ఉండాలి.
Tm విలువ వీలైనంత వరకు 55-65°C మధ్య ఉండాలి, సాధారణంగా దాదాపు 60°C, మరియు అప్‌స్ట్రీమ్ మరియు దిగువన ఉన్న Tm విలువ వీలైనంత దగ్గరగా ఉండాలి, ప్రాధాన్యంగా 4°C కంటే ఎక్కువ ఉండకూడదు.
4. ప్రైమర్ యొక్క 3′ చివరలో Aని ఎంచుకోవడం మానుకోండి
ప్రైమర్ యొక్క 3′ ముగింపు సరిపోలనప్పుడు, వివిధ స్థావరాల సంశ్లేషణ సామర్థ్యంలో గొప్ప వ్యత్యాసాలు ఉన్నాయి.చివరి ఆధారం A అయినప్పుడు, ఇది సరిపోలని సందర్భంలో కూడా గొలుసు సంశ్లేషణను ప్రారంభించగలదు మరియు చివరి ఆధారం T ఎప్పుడు అయినప్పుడు, అసమతుల్యత ఇండక్షన్ యొక్క సామర్థ్యం బాగా తగ్గిపోతుంది.అందువల్ల, ప్రైమర్ యొక్క 3′ చివరలో Aని ఎంచుకోకుండా ఉండటానికి ప్రయత్నించండి మరియు Tని ఎంచుకోవడం మంచిది.
ఇది ప్రోబ్ ప్రైమర్ అయితే, ప్రోబ్ యొక్క 5′ ముగింపు G కాకూడదు, ఎందుకంటే ఒకే G బేస్ FAM ఫ్లోరోసెంట్ రిపోర్టర్ సమూహానికి కనెక్ట్ చేయబడినప్పటికీ, G FAM సమూహం ద్వారా విడుదలయ్యే ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్‌ను కూడా అణచివేయగలదు, ఫలితంగా తప్పుడు ప్రతికూల ఫలితాలు వస్తాయి.కనిపించు.
5. బేస్ పంపిణీ
ప్రైమర్‌లోని నాలుగు బేస్‌ల పంపిణీ యాదృచ్ఛికంగా ఉంటుంది, 3′ చివరలో వరుసగా 3 కంటే ఎక్కువ G లేదా Cని తప్పించడం మరియు వరుసగా 3 కంటే ఎక్కువGC-రిచ్ సీక్వెన్స్ రీజియన్‌లో G లేదా C జత చేయడం సులభం.
6. ప్రైమర్ డిజైన్ ప్రాంతం సంక్లిష్టమైన ద్వితీయ నిర్మాణాలను నివారించాలి.
యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తి యొక్క సింగిల్ స్ట్రాండ్ ద్వారా ఏర్పడిన ద్వితీయ నిర్మాణం PCR యొక్క మృదువైన పురోగతిని ప్రభావితం చేస్తుంది.లక్ష్య శ్రేణిలో ద్వితీయ నిర్మాణం ఉందో లేదో ముందుగానే అంచనా వేయడం ద్వారా, ప్రైమర్‌ల రూపకల్పనలో ఈ ప్రాంతాన్ని నివారించడానికి ప్రయత్నించండి.
7. ప్రైమర్‌లు స్వయంగా మరియు ప్రైమర్‌ల మధ్య వరుస పరిపూరకరమైన స్థావరాలను నివారించడానికి ప్రయత్నించాలి.
ప్రైమర్ మరియు ప్రైమర్ మధ్య వరుసగా 4 బేస్ కాంప్లిమెంటరిటీ ఉండకూడదు.ప్రైమర్ దానికదే పరిపూరకరమైన క్రమాన్ని కలిగి ఉండకూడదు, లేకుంటే అది ఒక హెయిర్‌పిన్ నిర్మాణాన్ని ఏర్పరుచుకోవడానికి దానికదే ముడుచుకుంటుంది, ఇది ప్రైమర్ మరియు టెంప్లేట్ యొక్క ఎనియలింగ్ కలయికను ప్రభావితం చేస్తుంది.
అప్‌స్ట్రీమ్ మరియు డౌన్‌స్ట్రీమ్ ప్రైమర్‌ల మధ్య కాంప్లిమెంటరీ సీక్వెన్సులు ఉండకూడదు.ప్రైమర్‌ల మధ్య కాంప్లిమెంటారిటీ ప్రైమర్ డైమర్‌లను ఉత్పత్తి చేస్తుంది, ఇది PCR సామర్థ్యాన్ని తగ్గిస్తుంది మరియు పరిమాణాత్మక ఖచ్చితత్వాన్ని కూడా ప్రభావితం చేస్తుంది.ప్రైమర్-డైమర్ మరియు హెయిర్‌పిన్ నిర్మాణాలు అనివార్యమైనట్లయితే, △G విలువ చాలా ఎక్కువగా ఉండకూడదు (4.5 kcal/mol కంటే తక్కువ ఉండాలి).
8. ప్రైమర్‌లు లక్ష్య నిర్దిష్ట ఉత్పత్తిని విస్తరింపజేస్తాయి.
qPCR గుర్తింపు యొక్క అంతిమ లక్ష్యం లక్ష్య జన్యువు యొక్క సమృద్ధిని అర్థం చేసుకోవడం.నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ జరిగితే, పరిమాణీకరణ సరికాదు.అందువల్ల, ప్రైమర్‌లను రూపొందించిన తర్వాత, అవి BLAST ద్వారా పరీక్షించబడాలి మరియు ఉత్పత్తుల యొక్క విశిష్టత క్రమం డేటాబేస్‌లో పోల్చబడుతుంది.
తరువాత, మేము qPCR ప్రైమర్‌లను రూపొందించడానికి మానవ GAS6 (గ్రోత్ అరెస్ట్ నిర్దిష్ట 6) జన్యువును ఉదాహరణగా తీసుకుంటాము.
01 ప్రశ్న జన్యువు
హోమో GAS6NCBI ద్వారాఇక్కడ, జన్యు పేరు మరియు జాతులు స్థిరంగా ఉన్నాయని నిర్ధారించుకోవడానికి వాటిని పోల్చడంపై మనం శ్రద్ధ వహించాలి.
02 జన్యు శ్రేణిని కనుగొనండి
(1) లక్ష్య శ్రేణి జన్యుసంబంధమైన DNA అయితే, మొదటిదాన్ని ఎంచుకోండి, ఇది జన్యువు యొక్క జన్యుసంబంధమైన DNA శ్రేణి.
(2) టార్గెట్ సీక్వెన్స్ mRNA అయితే, రెండవదాన్ని ఎంచుకోండి.నమోదు చేసిన తర్వాత, దిగువ పట్టికలో "CDS" క్లిక్ చేయండి.బ్రౌన్ బ్యాక్‌గ్రౌండ్ సీక్వెన్స్ అనేది జన్యువు యొక్క కోడింగ్ సీక్వెన్స్.
03 డిజైన్ ప్రైమర్‌లు
ప్రైమర్-బ్లాస్ట్ ఇంటర్‌ఫేస్‌ని నమోదు చేయండి
ఎగువ ఎడమవైపున ఫాస్టా ఫార్మాట్‌లో జన్యు శ్రేణి సంఖ్య లేదా క్రమాన్ని నమోదు చేయండి మరియు సంబంధిత పారామితులను పూరించండి.

“ప్రైమర్‌లను పొందండి” క్లిక్ చేయండి మరియు అటువంటి పారామీటర్ ఎంపిక ఇతర స్ప్లికింగ్ వేరియంట్‌లకు విస్తరించబడుతుందని మీకు తెలియజేయడానికి NCBI పాప్ అప్ అవుతుంది.మేము వివిధ స్ప్లికింగ్ వేరియంట్‌లను తనిఖీ చేయవచ్చు మరియు తగిన ప్రైమర్ జతని పొందడానికి వాటిని సమర్పించవచ్చు (క్రింద చిత్రంలో చూపిన విధంగా).ఈ ప్రక్రియ అమలు కావడానికి పదుల సెకన్లు పట్టవచ్చు.
ఈ ప్రైమర్ జతల యొక్క ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతలు దాదాపు 60°C.ప్రయోగం యొక్క ఉద్దేశ్యం ప్రకారం, ప్రయోగం కోసం ప్రైమర్‌ల యొక్క మితమైన పొడవు, మంచి నిర్దిష్టత మరియు తక్కువ స్వీయ-పూర్తితో ప్రైమర్‌లను ఎంచుకోండి మరియు విజయం రేటు చాలా ఎక్కువగా ఉంటుంది!
04 ప్రైమర్ స్పెసిసిటీ వెరిఫికేషన్
నిజానికి, ప్రైమర్‌ల రూపకల్పనతో పాటు, ప్రైమర్-బ్లాస్ట్ మనం రూపొందించిన ప్రైమర్‌లను కూడా అంచనా వేయగలదు.ప్రైమర్ డిజైన్ పేజీకి తిరిగి వెళ్లి, మేము రూపొందించిన అప్‌స్ట్రీమ్ మరియు డౌన్‌స్ట్రీమ్ ప్రైమర్‌లను నమోదు చేయండి మరియు ఇతర పారామీటర్‌లు సర్దుబాటు చేయబడవు.సమర్పించిన తర్వాత, ప్రైమర్‌ల జత ఇతర జన్యువులలో కూడా ఉందో లేదో మీరు చూడవచ్చు.అవన్నీ మనం విస్తరించాలనుకుంటున్న జన్యువుపై ప్రదర్శించబడితే, ఈ జంట ప్రైమర్‌ల ప్రత్యేకత గొప్పదని సూచిస్తుంది!(ఉదాహరణకు, ఇది ప్రైమర్ ప్రశ్న యొక్క ఏకైక ఫలితం!)

05 ప్రైమర్ నాణ్యత తీర్పు
“అప్లిఫికేషన్ ఎఫిషియెన్సీ అప్ స్టాండర్డ్”, “యాంప్లిఫైడ్ ప్రొడక్ట్ లక్షణాలు” మరియు “విశ్వసనీయమైన ప్రయోగాత్మక ఫలితాలు” కలిపి ఉండే “పర్ఫెక్ట్” ప్రైమర్ ఏ రకమైన ప్రైమర్?
యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం

ద్రవీభవన వక్రత
ప్రైమర్‌ల యొక్క యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం 90%-110%కి చేరుకుంటుంది, అంటే యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం మంచిది మరియు ద్రవీభవన వక్రరేఖ ఒకే శిఖరాన్ని కలిగి ఉంటుంది మరియు సాధారణంగా Tm>80°C ఉంటుంది, అంటే యాంప్లిఫికేషన్ విశిష్టత మంచిది.
 
సంబంధిత ఉత్పత్తులు:
రియల్ టైమ్ PCR ఈజీ-SYBR గ్రీన్ I
రియల్ టైమ్ PCR ఈజీ-తక్మాన్