• PCR అనేది DNA టెంప్లేట్ యొక్క చిన్న మొత్తం నుండి DNA ని విస్తరించడానికి ఉపయోగించే ఒక పద్ధతి.RT-PCR ఒక RNA మూలం నుండి DNA టెంప్లేట్‌ను ఉత్పత్తి చేయడానికి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌ను ఉపయోగిస్తుంది, అది విస్తరించబడుతుంది.
• PCR మరియు RT-PCR సాధారణంగా ఎండ్‌పాయింట్ ప్రతిచర్యలు, అయితే qPCR మరియు RT-qPCR ప్రస్తుతం ఉన్న టెంప్లేట్ మొత్తాన్ని లెక్కించడానికి PCR ప్రతిచర్య సమయంలో ఉత్పత్తి సంశ్లేషణ రేటు యొక్క గతిశాస్త్రాన్ని ఉపయోగిస్తాయి.
• డిజిటల్ PCR వంటి కొత్త పద్ధతులు, ప్రారంభ DNA టెంప్లేట్ యొక్క సంపూర్ణ పరిమాణాన్ని అందిస్తాయి, అయితే ఐసోథర్మల్ PCR వంటి పద్ధతులు విశ్వసనీయ ఫలితాలను అందించడానికి ఖరీదైన పరికరాల అవసరాన్ని తగ్గిస్తాయి.

పాలిమరేస్ చైన్ రియాక్షన్ (PCR) అనేది DNA మరియు RNA సీక్వెన్స్‌లను విస్తరించడానికి మరియు గుర్తించడానికి సాపేక్షంగా సరళమైన మరియు విస్తృతంగా ఉపయోగించే మాలిక్యులర్ బయాలజీ టెక్నిక్.DNA క్లోనింగ్ మరియు యాంప్లిఫికేషన్ యొక్క సాంప్రదాయ పద్ధతులతో పోలిస్తే, తరచుగా రోజులు పట్టవచ్చు, PCRకి కొన్ని గంటలు మాత్రమే అవసరం.PCR అత్యంత సున్నితమైనది మరియు నిర్దిష్ట సన్నివేశాలను గుర్తించడం మరియు విస్తరించడం కోసం కనీస టెంప్లేట్ అవసరం.ప్రాథమిక PCR పద్ధతులు సాధారణ DNA మరియు RNA గుర్తింపు నుండి మరింత అభివృద్ధి చెందాయి.క్రింద, మేము మీ పరిశోధన అవసరాల కోసం ఎంజో లైఫ్ సైన్సెస్‌లో అందించే విభిన్న PCR పద్ధతులు మరియు రియాజెంట్‌ల యొక్క అవలోకనాన్ని అందించాము.శాస్త్రవేత్తలు వారి తదుపరి పరిశోధన ప్రాజెక్ట్‌లో ఉపయోగించడానికి PCR రియాజెంట్‌లను త్వరగా యాక్సెస్ చేయడంలో సహాయపడాలని మేము లక్ష్యంగా పెట్టుకున్నాము!

PCR

ప్రామాణిక PCR కోసం, మీకు కావలసిందల్లా DNA పాలిమరేస్, మెగ్నీషియం, న్యూక్లియోటైడ్‌లు, ప్రైమర్‌లు, విస్తరించాల్సిన DNA టెంప్లేట్ మరియు థర్మోసైక్లర్.PCR మెకానిజం దాని ఉద్దేశ్యం వలె చాలా సులభం: 1) డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA (dsDNA) హీట్ డీనాట్ చేయబడింది, 2) ప్రైమర్‌లు సింగిల్ DNA స్ట్రాండ్‌లకు సమలేఖనం చేయబడతాయి మరియు 3) ప్రైమర్‌లు DNA పాలిమరేస్ ద్వారా విస్తరించబడతాయి, ఫలితంగా రెండు కాపీలు అసలు DNA స్ట్రాండ్.ఉష్ణోగ్రతలు మరియు సమయాల శ్రేణిలో డీనాటరేషన్, ఎనియలింగ్ మరియు పొడిగింపు ప్రక్రియను యాంప్లిఫికేషన్ యొక్క ఒక చక్రం అంటారు (Fig. 1).

ఉపయోగించిన టెంప్లేట్ మరియు ప్రైమర్ సెట్ కోసం చక్రం యొక్క ప్రతి దశను ఆప్టిమైజ్ చేయాలి.ఈ చక్రం సుమారు 20-40 సార్లు పునరావృతమవుతుంది, మరియు విస్తరించిన ఉత్పత్తిని విశ్లేషించవచ్చు, సాధారణంగా అగరోజ్ జెల్ (Fig. 2).

PCR అనేది అత్యంత సున్నితమైన పద్ధతి మరియు ఒకే ప్రతిచర్యలకు చాలా చిన్న వాల్యూమ్‌లు అవసరం కాబట్టి, అనేక ప్రతిచర్యల కోసం మాస్టర్ మిక్స్‌ని తయారు చేయడం సిఫార్సు చేయబడింది.మాస్టర్ మిక్స్‌ను బాగా కలపాలి మరియు తర్వాత ప్రతిచర్యల సంఖ్యతో విభజించాలి, ప్రతి ప్రతిచర్యలో అదే మొత్తంలో ఎంజైమ్, dNTPలు మరియు ప్రైమర్‌లు ఉండేలా చూసుకోవాలి.ఎంజో లైఫ్ సైన్సెస్ వంటి చాలా మంది సరఫరాదారులు కూడా ఇప్పటికే ప్రైమర్‌లు మరియు DNA టెంప్లేట్ మినహా అన్నింటినీ కలిగి ఉన్న PCR మిశ్రమాలను అందిస్తారు.

గ్వానైన్/సైటోసిన్-రిచ్ (GC-రిచ్) ప్రాంతాలు ప్రామాణిక PCR పద్ధతుల్లో సవాలును సూచిస్తాయి.తక్కువ GC కంటెంట్ ఉన్న సీక్వెన్స్‌ల కంటే GC-రిచ్ సీక్వెన్స్‌లు మరింత స్థిరంగా ఉంటాయి.ఇంకా, GC-రిచ్ సీక్వెన్సులు హెయిర్‌పిన్ లూప్‌ల వంటి ద్వితీయ నిర్మాణాలను ఏర్పరుస్తాయి.ఫలితంగా, డీనాటరేషన్ దశలో GC-రిచ్ డబుల్ స్ట్రాండ్‌లను పూర్తిగా వేరు చేయడం కష్టం.పర్యవసానంగా, DNA పాలిమరేస్ కొత్త స్ట్రాండ్‌ను అడ్డంకులు లేకుండా సంశ్లేషణ చేయదు.అధిక డీనాటరేషన్ ఉష్ణోగ్రత దీనిని మెరుగుపరుస్తుంది మరియు అధిక ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత మరియు తక్కువ ఎనియలింగ్ సమయం వైపు సర్దుబాట్లు GC-రిచ్ ప్రైమర్‌ల నిర్ధిష్ట బైండింగ్‌ను నిరోధించగలవు.అదనపు కారకాలు GC-రిచ్ సీక్వెన్స్‌ల విస్తరణను మెరుగుపరుస్తాయి.DMSO, గ్లిసరాల్ మరియు బీటైన్ GC పరస్పర చర్యల వల్ల ఏర్పడే ద్వితీయ నిర్మాణాలకు అంతరాయం కలిగించడంలో సహాయపడతాయి మరియు తద్వారా డబుల్ స్ట్రాండ్‌ల విభజనను సులభతరం చేస్తాయి.

హాట్ స్టార్ట్ PCR

పేర్కొనబడని యాంప్లిఫికేషన్ అనేది PCR సమయంలో సంభవించే సమస్య.PCR కోసం ఉపయోగించే చాలా DNA పాలిమరేసులు 68°C నుండి 72°C ఉష్ణోగ్రతల వద్ద ఉత్తమంగా పని చేస్తాయి.ఎంజైమ్, అయితే, తక్కువ స్థాయిలో ఉన్నప్పటికీ, తక్కువ ఉష్ణోగ్రతల వద్ద కూడా చురుకుగా ఉంటుంది.ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత కంటే చాలా తక్కువ ఉష్ణోగ్రతల వద్ద, ప్రైమర్‌లు నిర్దిష్టంగా బంధించబడవచ్చు మరియు మంచుపై ప్రతిచర్యను ఏర్పాటు చేసినప్పటికీ, నిర్దిష్ట-కాని విస్తరణకు దారి తీస్తుంది.ఒక నిర్దిష్ట ఉష్ణోగ్రత చేరుకున్న తర్వాత మాత్రమే DNA పాలిమరేస్ నుండి వేరుచేసే పాలిమరేస్ ఇన్హిబిటర్లను ఉపయోగించడం ద్వారా దీనిని నిరోధించవచ్చు, అందుకే హాట్ స్టార్ట్ PCR అనే పదం.ఇన్హిబిటర్ అనేది పాలీమరేస్‌ను బంధించే యాంటీబాడీ మరియు ప్రారంభ డీనాటరేషన్ ఉష్ణోగ్రత వద్ద (సాధారణంగా 95 ° C).

హై ఫిడిలిటీ పాలిమరేస్

DNA పాలిమరేసెస్ అసలైన టెంప్లేట్ సీక్వెన్స్‌కు చాలా ఖచ్చితంగా విస్తరించినప్పటికీ, న్యూక్లియోటైడ్ మ్యాచింగ్‌లో తప్పులు సంభవించవచ్చు.క్లోనింగ్ వంటి అప్లికేషన్‌లలో అసమతుల్యత ఫలితంగా కత్తిరించబడిన ట్రాన్‌స్క్రిప్ట్‌లు మరియు తప్పుగా అనువదించబడిన లేదా క్రియారహిత ప్రోటీన్‌లు దిగువకు వస్తాయి.ఈ అసమతుల్యతలను నివారించడానికి, "ప్రూఫ్ రీడింగ్" కార్యకలాపంతో కూడిన పాలిమరేసులు గుర్తించబడ్డాయి మరియు వర్క్‌ఫ్లోలో చేర్చబడ్డాయి.మొదటి ప్రూఫ్ రీడింగ్ పాలిమరేస్, Pfu, 1991లో పైరోకోకస్ ఫ్యూరియోసస్‌లో గుర్తించబడింది.ఈ Pfu ఎంజైమ్ 3' నుండి 5' ఎక్సోన్యూకలీస్ కార్యాచరణను కలిగి ఉంటుంది.DNA విస్తరించబడినందున, ఎక్సోన్యూకలీస్ స్ట్రాండ్ యొక్క 3' చివరలో సరిపోలని న్యూక్లియోటైడ్‌లను తొలగిస్తుంది.అప్పుడు సరైన న్యూక్లియోటైడ్ భర్తీ చేయబడుతుంది మరియు DNA సంశ్లేషణ కొనసాగుతుంది.సరికాని న్యూక్లియోటైడ్ సీక్వెన్స్‌ల గుర్తింపు అనేది ఎంజైమ్‌తో సరైన న్యూక్లియోసైడ్ ట్రైఫాస్ఫేట్‌కు బంధన అనుబంధంపై ఆధారపడి ఉంటుంది, ఇక్కడ అసమర్థ బంధం సంశ్లేషణను నెమ్మదిస్తుంది మరియు సరైన భర్తీకి అనుమతిస్తుంది.Pfu పాలిమరేస్ యొక్క ప్రూఫ్ రీడింగ్ యాక్టివిటీ Taq DNA పాలిమరేస్‌తో పోలిస్తే తుది క్రమంలో తక్కువ లోపాలను కలిగిస్తుంది.ఇటీవలి సంవత్సరాలలో, ఇతర ప్రూఫ్ రీడింగ్ ఎంజైమ్‌లు గుర్తించబడ్డాయి మరియు DNA యాంప్లిఫికేషన్ సమయంలో లోపం రేటును మరింత తగ్గించడానికి అసలు Pfu ఎంజైమ్ యొక్క మార్పులు చేయబడ్డాయి.

RT-PCR

రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ PCR, లేదా RT-PCR, RNAను టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించడాన్ని అనుమతిస్తుంది.ఒక అదనపు దశ RNA యొక్క గుర్తింపు మరియు విస్తరణను అనుమతిస్తుంది.RNA రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్‌ని ఉపయోగించి కాంప్లిమెంటరీ DNA (cDNA)లోకి రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్ చేయబడింది.RT-PCR విజయానికి RNA టెంప్లేట్ యొక్క నాణ్యత మరియు స్వచ్ఛత అవసరం.RT-PCR యొక్క మొదటి దశ DNA/RNA హైబ్రిడ్ సంశ్లేషణ.రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ కూడా RNase H ఫంక్షన్‌ను కలిగి ఉంది, ఇది హైబ్రిడ్ యొక్క RNA భాగాన్ని క్షీణింపజేస్తుంది.సింగిల్-స్ట్రాండ్ DNA అణువు అప్పుడు cDNA లోకి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ యొక్క DNA-ఆధారిత DNA పాలిమరేస్ కార్యాచరణ ద్వారా పూర్తి చేయబడుతుంది.మొదటి-స్ట్రాండ్ ప్రతిచర్య యొక్క సామర్థ్యం యాంప్లిఫికేషన్ ప్రక్రియను ప్రభావితం చేస్తుంది.ఇక్కడ నుండి, cDNAని విస్తరించడానికి ప్రామాణిక PCR విధానం ఉపయోగించబడుతుంది.RT-PCR ద్వారా RNAను cDNAలోకి మార్చే అవకాశం చాలా ప్రయోజనాలను కలిగి ఉంది మరియు ఇది ప్రధానంగా జన్యు వ్యక్తీకరణ విశ్లేషణ కోసం ఉపయోగించబడుతుంది.RNA సింగిల్-స్ట్రాండ్ మరియు చాలా అస్థిరంగా ఉంటుంది, ఇది పని చేయడం సవాలుగా చేస్తుంది.ఇది సాధారణంగా qPCR లో మొదటి దశగా పనిచేస్తుంది, ఇది జీవ నమూనాలో RNA ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లను గణిస్తుంది.

qPCR మరియు RT-qPCR

క్వాంటిటేటివ్ PCR (qPCR) అనేక అనువర్తనాల కోసం న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాలను గుర్తించడానికి, వర్గీకరించడానికి మరియు లెక్కించడానికి ఉపయోగించబడుతుంది.RT-qPCRలో, RNA ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు పైన వివరించిన విధంగా మొదట వాటిని cDNAలోకి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్ చేయడం ద్వారా తరచుగా లెక్కించబడతాయి, ఆపై qPCR తరువాత నిర్వహించబడుతుంది.ప్రామాణిక PCRలో వలె, DNA మూడు పునరావృత దశల ద్వారా విస్తరించబడుతుంది: డీనాటరేషన్, ఎనియలింగ్ మరియు పొడుగు.అయినప్పటికీ, qPCR లో, ఫ్లోరోసెంట్ లేబులింగ్ PCR అభివృద్ధి చెందుతున్నప్పుడు డేటా సేకరణను అనుమతిస్తుంది.అందుబాటులో ఉన్న పద్ధతులు మరియు రసాయనాల శ్రేణి కారణంగా ఈ సాంకేతికత అనేక ప్రయోజనాలను కలిగి ఉంది.

రంగు-ఆధారిత qPCR (సాధారణంగా ఆకుపచ్చ) లో, ఫ్లోరోసెంట్ లేబులింగ్ dsDNA బైండింగ్ డైని ఉపయోగించడం ద్వారా విస్తరించిన DNA అణువుల పరిమాణాన్ని అనుమతిస్తుంది.ప్రతి చక్రంలో, ఫ్లోరోసెన్స్ కొలుస్తారు.ప్రతిరూప DNA మొత్తానికి అనులోమానుపాతంలో ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్ పెరుగుతుంది.అందువల్ల, DNA "నిజ సమయంలో" లెక్కించబడుతుంది (Fig. 3).డై-ఆధారిత qPCR యొక్క ప్రతికూలతలు ఏమిటంటే, ఒకేసారి ఒక లక్ష్యాన్ని మాత్రమే పరిశీలించవచ్చు మరియు నమూనాలో ఉన్న ఏదైనా ds-DNAకి రంగు కట్టుబడి ఉంటుంది.

ప్రోబ్-ఆధారిత qPCRలో, ప్రతి నమూనాలో అనేక లక్ష్యాలను ఏకకాలంలో గుర్తించవచ్చు, అయితే దీనికి ప్రైమర్‌లకు అదనంగా ఉపయోగించే లక్ష్య-నిర్దిష్ట ప్రోబ్(లు) యొక్క ఆప్టిమైజేషన్ మరియు రూపకల్పన అవసరం.అనేక రకాల ప్రోబ్ డిజైన్‌లు అందుబాటులో ఉన్నాయి, అయితే అత్యంత సాధారణ రకం జలవిశ్లేషణ ప్రోబ్, ఇది ఫ్లోరోఫోర్ మరియు క్వెన్చర్‌ను కలిగి ఉంటుంది.ఫ్లోరోసెన్స్ రెసొనెన్స్ ఎనర్జీ ట్రాన్స్‌ఫర్ (FRET) ప్రోబ్ చెక్కుచెదరకుండా ఉన్నప్పుడు క్వెన్చర్ ద్వారా ఫ్లోరోఫోర్ యొక్క ఉద్గారాలను నిరోధిస్తుంది.అయినప్పటికీ, PCR ప్రతిచర్య సమయంలో, ప్రోబ్ ప్రైమర్ ఎక్స్‌టెన్షన్ సమయంలో హైడ్రోలైజ్ చేయబడుతుంది మరియు దానికి కట్టుబడి ఉండే నిర్దిష్ట క్రమం యొక్క విస్తరణ జరుగుతుంది.ప్రోబ్ యొక్క చీలిక క్వెన్చర్ నుండి ఫ్లోరోఫోర్‌ను వేరు చేస్తుంది మరియు ఫ్లోరోసెన్స్‌లో యాంప్లిఫికేషన్-ఆధారిత పెరుగుదలకు దారితీస్తుంది (Fig. 4).అందువల్ల, ప్రోబ్-ఆధారిత qPCR ప్రతిచర్య నుండి వచ్చే ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్ నమూనాలో ఉన్న ప్రోబ్ టార్గెట్ సీక్వెన్స్ మొత్తానికి అనులోమానుపాతంలో ఉంటుంది.డై-ఆధారిత qPCR కంటే ప్రోబ్-ఆధారిత qPCR మరింత నిర్దిష్టంగా ఉంటుంది కాబట్టి, ఇది తరచుగా qPCR-ఆధారిత డయాగ్నస్టిక్ అస్సేస్‌లో ఉపయోగించే సాంకేతికత.

ఐసోథర్మల్ యాంప్లిఫికేషన్

పైన పేర్కొన్న PCR సాంకేతికతలను డీనాటరేషన్, ఎనియలింగ్ మరియు పొడిగింపు దశల కోసం ఛాంబర్ ఉష్ణోగ్రతలను ఖచ్చితంగా పైకి క్రిందికి పెంచడానికి ఖరీదైన థర్మోసైక్లింగ్ పరికరాలు అవసరం.అటువంటి ఖచ్చితమైన పరికరాలు అవసరం లేని అనేక సాంకేతికతలు అభివృద్ధి చేయబడ్డాయి మరియు సాధారణ నీటి స్నానంలో లేదా ఆసక్తి ఉన్న కణాలలో కూడా నిర్వహించబడతాయి.ఈ పద్ధతులను సమిష్టిగా ఐసోథర్మల్ యాంప్లిఫికేషన్ అని పిలుస్తారు మరియు ఎక్స్‌పోనెన్షియల్, లీనియర్ లేదా క్యాస్కేడ్ యాంప్లిఫికేషన్ ఆధారంగా పని చేస్తాయి.

ఐసోథర్మల్ యాంప్లిఫికేషన్ యొక్క అత్యంత ప్రసిద్ధ రకం లూప్-మెడియేటెడ్ ఐసోథర్మల్ యాంప్లిఫికేషన్ లేదా LAMP.LAMP టెంప్లేట్ DNA లేదా RNAని విస్తరించడానికి 65⁰C వద్ద ఎక్స్‌పోనెన్షియల్ యాంప్లిఫికేషన్‌ను ఉపయోగిస్తుంది.LAMP చేస్తున్నప్పుడు, కొత్త DNAను సంశ్లేషణ చేయడానికి DNA పాలిమరేస్‌తో లక్ష్య DNA యొక్క ప్రాంతాలకు అనుబంధంగా నాలుగు నుండి ఆరు ప్రైమర్‌లు ఉపయోగించబడతాయి.ఈ ప్రైమర్‌లలో రెండు కాంప్లిమెంటరీ సీక్వెన్స్‌లను కలిగి ఉంటాయి, ఇవి ఇతర ప్రైమర్‌లలోని సీక్వెన్స్‌లను గుర్తించి వాటిని బంధిస్తాయి, కొత్తగా సంశ్లేషణ చేయబడిన DNAలో "లూప్" నిర్మాణం ఏర్పడటానికి వీలు కల్పిస్తుంది, ఇది తదుపరి రౌండ్ల విస్తరణలో ప్రైమర్ ఎనియలింగ్‌కు సహాయపడుతుంది.ఫ్లోరోసెన్స్, అగరోస్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ లేదా కలర్మెట్రీతో సహా పలు పద్ధతుల ద్వారా LAMPని దృశ్యమానం చేయవచ్చు.కలర్‌మెట్రీ ద్వారా ఉత్పత్తి యొక్క ఉనికి లేదా లేకపోవడాన్ని సులభంగా విజువలైజ్ చేయడం మరియు గుర్తించడం మరియు అవసరమైన ఖరీదైన పరికరాలు లేకపోవడం వల్ల క్లినికల్ ల్యాబ్ టెస్టింగ్ తక్షణమే అందుబాటులో లేని ప్రాంతాలలో LAMP SARS-CoV-2 పరీక్షకు తగిన ఎంపిక లేదా నమూనాల నిల్వ మరియు రవాణా. ఇది సాధ్యం కాదు, లేదా ఇంతకుముందు PCR థర్మోసైక్లింగ్ పరికరాలు లేని ల్యాబ్‌లలో.