Ⅰ. ప్రతిచర్య వ్యవస్థ యొక్క సున్నితత్వాన్ని పెంచండి:

1. ప్రత్యేక అధిక-నాణ్యత RNA:

విజయవంతమైన cDNA సంశ్లేషణ అధిక-నాణ్యత RNA నుండి వచ్చింది.అధిక-నాణ్యత RNA కనీసం మొత్తం ఎక్కువసేపు ఉండేలా చూడాలి మరియు EDTA లేదా SDS వంటి రికార్డింగ్ ఎంజైమ్‌లను కలిగి ఉండని నిరోధకాలను కలిగి ఉండదు.RNA యొక్క నాణ్యత మీరు cDNAకి లిప్యంతరీకరించగల సీక్వెన్స్ సమాచారం యొక్క గరిష్ట విలువను నిర్ణయిస్తుంది.సాధారణ RNA శుద్దీకరణ పద్ధతి isoocyanate/acidophenolను ఉపయోగించే ఒక దశ పద్ధతి.RNase యొక్క కాలుష్యాన్ని నివారించడానికి, RNase (ప్యాంక్రియాస్ వంటివి) అధికంగా ఉన్న నమూనా నుండి వేరు చేయబడిన RNA అధిక-నాణ్యత RNAని సేవ్ చేయడానికి ఫార్మాల్డిహైడ్ నిల్వ అవసరం, ఇది దీర్ఘకాలిక నిల్వ కోసం మరింత ఎక్కువగా ఉంటుంది.ఎలుక కాలేయం నుండి సేకరించిన RNA ప్రాథమికంగా నీటిలో ఒక వారం నిల్వ తర్వాత క్షీణించింది, అయితే ఎలుక ప్లీహము నుండి సేకరించిన RNA నీటిలో మూడు సంవత్సరాల నిల్వ తర్వాత స్థిరంగా ఉంటుంది.అదనంగా, చిన్న ట్రాన్‌స్క్రిప్ట్‌ల కంటే 4kb కంటే పెద్ద ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు RNase క్షీణతను గుర్తించడానికి ఎక్కువ సున్నితంగా ఉంటాయి.నిల్వ RNA నమూనా యొక్క స్థిరత్వాన్ని పెంచడానికి, RNAను అయాన్ యొక్క మెథాల్‌మమైన్‌లో కరిగించవచ్చు మరియు -70 °C నిల్వ చేయబడుతుంది.ఆర్‌ఎన్‌ఏను సేవ్ చేయడానికి ఉపయోగించే థైలైడ్‌లో ఆర్‌ఎన్‌ఏను క్షీణింపజేసే ఇతర వస్తువులు ఉండకూడదు.ప్యాంక్రియాస్ నుండి తీసుకోబడిన ఆర్‌ఎన్‌ఏ కనీసం ఒక సంవత్సరం పాటు మిథాల్‌మమైన్‌లో భద్రపరచబడుతుంది.మీరు RNAని ఉపయోగించడానికి సిద్ధంగా ఉన్నప్పుడు, మీరు RNAను అవక్షేపించడానికి క్రింది పద్ధతులను ఉపయోగించవచ్చు: NaClని 0.2m మరియు 4 రెట్లు ఇథనాల్ వాల్యూమ్‌కు జోడించండి, గది ఉష్ణోగ్రతను 3-5 నిమిషాలు ఉంచండి మరియు 10,000 × g సెంట్రిఫ్యూగల్‌ను 5 నిమిషాలు ఉంచండి.

2. RNaseH కార్యాచరణ (RNaseH-) లేకుండా రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్‌ని ఉపయోగించండి:

cDNA సంశ్లేషణ యొక్క పొడవు మరియు దిగుబడిని పెంచడానికి RNase ఇన్హిబిటర్లు తరచుగా రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ప్రతిచర్యలకు జోడించబడతాయి.RNase ఇన్హిబిటర్ బఫర్‌ల సమక్షంలో మొదటి చైన్ సింథసిస్ రియాక్షన్‌లో జోడించబడుతుంది మరియు DTT వంటి ఏజెంట్లను తగ్గించడం జరుగుతుంది, ఎందుకంటే ప్రీ-సిడిఎన్‌ఎ సంశ్లేషణ ప్రక్రియ నిరోధకాన్ని నిర్వీర్యం చేస్తుంది, తద్వారా ఆర్‌ఎన్‌ఎను క్షీణింపజేసే బౌండ్ ఆర్‌నేస్‌లను విడుదల చేస్తుంది.ప్రొటీన్ RNase ఇన్హిబిటర్ RNase A, B, C ద్వారా RNA యొక్క క్షీణతను మాత్రమే నిరోధిస్తుంది మరియు చర్మంపై RNaseలను నిరోధించదు, కాబట్టి ఈ నిరోధకాలను ఉపయోగించినప్పటికీ వేళ్ల నుండి RNaseలను ప్రవేశపెట్టకుండా జాగ్రత్త వహించాలి.

రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ RNAను cDNAగా మార్చడాన్ని ఉత్ప్రేరకపరుస్తుంది.M-MLV మరియు AMV రెండూ వాటి స్వంత పాలిమరేస్ కార్యకలాపంతో పాటు అంతర్జాత RNaseH కార్యాచరణను కలిగి ఉంటాయి.RNaseH కార్యాచరణ RNA టెంప్లేట్‌లు మరియు DNA ప్రైమర్‌లు లేదా cDNA ఎక్స్‌టెన్షన్ స్ట్రాండ్‌ల మధ్య ఏర్పడిన హెటెరోజైగస్ స్ట్రాండ్‌ల కోసం పాలిమరేస్ కార్యాచరణతో పోటీపడుతుంది మరియు DNA కాంప్లెక్స్‌లలో RNA: RNA తంతువులను క్షీణింపజేస్తుంది.RNaseH కార్యాచరణ ద్వారా క్షీణించిన RNA టెంప్లేట్‌లు ఇకపై cDNA సంశ్లేషణకు సమర్థవంతమైన సబ్‌స్ట్రేట్‌లుగా ఉపయోగించబడవు, cDNA సంశ్లేషణ యొక్క దిగుబడి మరియు పొడవును తగ్గిస్తుంది.అందువల్ల రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ యొక్క RNaseH కార్యాచరణను తొలగించడం లేదా బాగా తగ్గించడం గొప్ప ప్రయోజనకరంగా ఉంటుంది.

సూపర్‌స్క్రిప్ట్Ⅱ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్, RNaseH- యొక్క MMLV రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ మరియు థర్మోస్క్రిప్ట్ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్, RNaseH- యొక్క AMV MMLV మరియు AMV కంటే ఎక్కువ పూర్తి-నిడివి గల cDNAని అందించాయి.RT-PCR సున్నితత్వం cDNA సంశ్లేషణ మొత్తం ద్వారా ప్రభావితమవుతుంది.AMV కంటే థర్మోస్క్రిప్ట్ చాలా సున్నితమైనది.RT-PCR ఉత్పత్తుల పరిమాణం cDNAను సంశ్లేషణ చేయడానికి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ సామర్థ్యం ద్వారా పరిమితం చేయబడింది, ముఖ్యంగా పెద్ద Cdnaలను క్లోనింగ్ చేసేటప్పుడు.MMLVతో పోలిస్తే, SuperScripⅡ సుదీర్ఘ RT-PCR ఉత్పత్తుల దిగుబడిని గణనీయంగా పెంచింది.RNaseH- యొక్క రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ థర్మల్ స్టెబిలిటీని కూడా పెంచుతుంది, కాబట్టి రియాక్షన్ సాధారణం కంటే 37-42℃ కంటే ఎక్కువ ఉష్ణోగ్రతల వద్ద నిర్వహించబడుతుంది.సూచించబడిన సంశ్లేషణ పరిస్థితులలో, ఒలిగో(dT) ప్రైమర్‌లు మరియు 10μCi [alpha-p]dCTP ఉపయోగించబడ్డాయి.మొదటి గొలుసు యొక్క మొత్తం ఉత్పత్తి TCA అవక్షేప పద్ధతిని ఉపయోగించి లెక్కించబడుతుంది.ఆల్కలీన్ అగరోజ్ జెల్‌లో పరిమాణం-క్రమబద్ధీకరించబడిన స్ట్రిప్ తొలగింపు మరియు లెక్కింపును ఉపయోగించి పూర్తి-నిడివి గల cDNA విశ్లేషించబడింది.

3. రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ యొక్క ఉష్ణ సంరక్షణ ఉష్ణోగ్రతను పెంచండి:

అధిక హోల్డింగ్ ఉష్ణోగ్రత RNA యొక్క ద్వితీయ నిర్మాణాన్ని తెరవడానికి మరియు ప్రతిచర్య యొక్క దిగుబడిని పెంచడానికి సహాయపడుతుంది.చాలా RNA టెంప్లేట్‌ల కోసం, బఫర్ లేదా ఉప్పు లేకుండా 65°C వద్ద RNA మరియు ప్రైమర్‌లను పట్టుకుని, ఆపై వాటిని మంచుపై త్వరగా చల్లబరచడం చాలా సెకండరీ నిర్మాణాలను తొలగిస్తుంది మరియు ప్రైమర్‌లను బంధించడానికి అనుమతిస్తుంది.అయినప్పటికీ, కొన్ని టెంప్లేట్‌లు థర్మల్ డీనాటరేషన్ తర్వాత కూడా ద్వితీయ నిర్మాణాన్ని కలిగి ఉంటాయి.థర్మోస్క్రిప్ట్ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్‌ని ఉపయోగించి మరియు యాంప్లిఫికేషన్‌ను మెరుగుపరచడానికి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ రియాక్షన్‌ను అధిక ఉష్ణోగ్రతల వద్ద ఉంచడం ద్వారా ఈ కష్టమైన టెంప్లేట్‌ల విస్తరణను నిర్వహించవచ్చు.అధిక హోల్డింగ్ ఉష్ణోగ్రతలు కూడా నిర్దిష్టతను పెంచుతాయి, ముఖ్యంగా cDNA సంశ్లేషణ జన్యు-నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌లను (GSPS) ఉపయోగించి నిర్వహించినప్పుడు (చాప్టర్ 3 చూడండి).GSPని ఉపయోగిస్తుంటే, ప్రైమర్ యొక్క Tm విలువ ఆశించిన హోల్డింగ్ ఉష్ణోగ్రతకు సమానంగా ఉందని నిర్ధారించుకోండి.ఒలిగో(dT) మరియు 60℃ కంటే ఎక్కువ రాండమ్ ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించవద్దు.ర్యాండమ్ ప్రైమర్‌లను 60℃కి పెంచడానికి ముందు 10 నిమిషాల పాటు 25℃ వద్ద ఉంచాలి.అధిక రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ఉష్ణోగ్రతలను ఉపయోగించడంతో పాటు, RNA/ప్రైమర్ మిశ్రమాన్ని 65℃ డినాటరింగ్ ఉష్ణోగ్రత నుండి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ హోల్డింగ్ ఉష్ణోగ్రతకు నేరుగా బదిలీ చేయడం ద్వారా మరియు ముందుగా వేడిచేసిన 2× ప్రతిచర్య మిశ్రమాన్ని (cDNA థర్మల్ ఇనిషియేషన్ సింథసిస్) జోడించడం ద్వారా నిర్దిష్టతను మెరుగుపరచవచ్చు.ఈ విధానం తక్కువ ఉష్ణోగ్రతల వద్ద సంభవించే ఇంటర్‌మోలిక్యులర్ బేస్ జతను నిరోధించడంలో సహాయపడుతుంది.PCR పరికరాన్ని ఉపయోగించడం RT-PCR కోసం అవసరమైన అనేక ఉష్ణోగ్రత స్విచ్‌లను సులభతరం చేస్తుంది.

Tth హీట్ స్టెబిలైజ్డ్ పాలిమరేస్ Mg2+ సమక్షంలో DNA పాలిమరేస్‌గా మరియు Mn2+ సమక్షంలో RNA పాలిమరేస్‌గా పనిచేస్తుంది.ఇది 65℃ వరకు వేడిని కలిగి ఉంటుంది.అయినప్పటికీ, PCR సమయంలో Mn2+ ఉండటం విశ్వసనీయతను తగ్గిస్తుంది, ఇది cDNA క్లోనింగ్ వంటి అధిక ఖచ్చితత్వ విస్తరణకు Tth పాలిమరేస్‌ను తక్కువ అనుకూలంగా చేస్తుంది.అదనంగా, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ వద్ద Tth తక్కువ సామర్థ్యం కలిగి ఉంటుంది, ఇది సున్నితత్వాన్ని తగ్గిస్తుంది మరియు ఒకే ఎంజైమ్ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ మరియు PCR చేయగలదు కాబట్టి, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ లేకుండా నియంత్రణ ప్రతిచర్యలు cDNA యొక్క విస్తరించిన ఉత్పత్తులను కలుషితమైన జన్యుసంబంధమైన DNA నుండి వేరు చేయడానికి ఉపయోగించబడవు.

4. రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌ను ప్రోత్సహించే సంకలితం:

మొదటి గొలుసు సంశ్లేషణ ప్రతిచర్యకు గ్లిజరిన్ మరియు DMSOతో సహా సంకలితాలను జోడించడం వలన న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ డబుల్ స్ట్రాండ్ యొక్క స్థిరత్వాన్ని తగ్గిస్తుంది మరియు RNA ద్వితీయ నిర్మాణాన్ని నిలిపివేయవచ్చు.SuperScriptⅡ లేదా MMLV యొక్క కార్యకలాపాన్ని ప్రభావితం చేయకుండా 20% వరకు గ్లిజరిన్ లేదా 10% DMSO జోడించవచ్చు.AMV కూడా యాక్టివిటీని తగ్గించకుండా 20% గ్లిసరాల్‌ను తట్టుకోగలదు.సూపర్‌స్క్రిప్ట్Ⅱ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ రియాక్షన్‌లో RT-PCR యొక్క సున్నితత్వాన్ని పెంచడానికి, 10% గ్లిసరాల్‌ను జోడించవచ్చు మరియు 45℃ వద్ద ఇన్సులేట్ చేయవచ్చు.రెట్రోట్రాన్స్క్రిప్షన్-రియాక్షన్ ఉత్పత్తిలో 1/10 PCRకి జోడించబడితే, యాంప్లిఫికేషన్ రియాక్షన్‌లో గ్లిసరాల్ యొక్క గాఢత 0.4%, ఇది PCRని నిరోధించడానికి సరిపోదు.

5. RNaseH ప్రాసెసింగ్:

PCRకి ముందు RNaseHతో cDNA సంశ్లేషణ ప్రతిచర్యలకు చికిత్స చేయడం ద్వారా సున్నితత్వాన్ని మెరుగుపరచవచ్చు.కొన్ని టెంప్లేట్‌ల కోసం, cDNA సంశ్లేషణ చర్యలోని RNA విస్తరించిన ఉత్పత్తులను బంధించడాన్ని నిరోధిస్తుంది, ఈ సందర్భంలో RNaseH చికిత్స సున్నితత్వాన్ని పెంచుతుంది.సాధారణంగా, తక్కువ కాపీతో ట్యూబరస్ స్కెరోసిస్Ⅱ వంటి సాపేక్షంగా పొడవైన పూర్తి-నిడివి గల cDNA లక్ష్య టెంప్లేట్ యొక్క విస్తరణకు RNaseH చికిత్స అవసరం.ఈ కష్టమైన టెంప్లేట్ కోసం, సూపర్‌స్క్రిప్ట్Ⅱ లేదా AMV ద్వారా సంశ్లేషణ చేయబడిన cDNA ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన సిగ్నల్‌ను RNaseH మెరుగుపరిచింది.చాలా RT-PCR ప్రతిచర్యలకు, RNaseH చికిత్స ఐచ్ఛికం ఎందుకంటే 95℃ ఇన్సులేటెడ్ PCR డీనాటరేషన్ దశ సాధారణంగా RNA: DNA కాంప్లెక్స్ నుండి RNAను హైడ్రోలైజ్ చేస్తుంది.

6. RNA యొక్క చిన్న మొత్తాలను గుర్తించడానికి మెరుగైన పద్ధతులు:

RT-PCR ముఖ్యంగా చిన్న మొత్తంలో RNA అందుబాటులో ఉన్నప్పుడు సవాలుగా ఉంటుంది.RNA విభజన సమయంలో గ్లైకోజెన్‌ను క్యారియర్‌గా చేర్చడం చిన్న నమూనాల దిగుబడిని పెంచడానికి సహాయపడుతుంది.ట్రైజోల్ మాదిరిగానే RNase-రహిత గ్లైకోజెన్‌ను జోడించవచ్చు.గ్లైకోజెన్ నీటిలో కరిగేది మరియు తదుపరి అవపాతంలో సహాయం చేయడానికి RNA తో నీటి దశలో ఉంటుంది.50mg కంటే తక్కువ కణజాలం లేదా 106 కల్చర్డ్ కణాలకు RNase-రహిత గ్లైకోజెన్ యొక్క సిఫార్సు సాంద్రత 250μg/ml.

సూపర్‌స్క్రిప్ట్Ⅱని ఉపయోగించి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ రియాక్షన్‌లకు ఎసిటైలేటెడ్ BSA జోడించడం వలన సున్నితత్వం పెరుగుతుంది మరియు తక్కువ మొత్తంలో RNA కోసం, సూపర్‌స్క్రిప్ట్Ⅱ మొత్తాన్ని తగ్గించడం మరియు RnaseOut న్యూక్లీస్ ఇన్హిబిటర్ యొక్క 40 యూనిట్లను జోడించడం ద్వారా గుర్తింపు స్థాయిని మెరుగుపరచవచ్చు.RNA వేరు చేయడంలో గ్లైకోజెన్ ఉపయోగించినట్లయితే, సూపర్‌స్క్రిప్ట్Ⅱని ఉపయోగించి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ప్రతిచర్యలకు BSA లేదా RNase ఇన్హిబిటర్‌లను జోడించడం ఇప్పటికీ సిఫార్సు చేయబడింది.

Ⅱ. RT-PCR యొక్క ప్రత్యేకతను పెంచండి

1. cNDA సంశ్లేషణ:

మొదటి స్ట్రాండ్ cDNA సంశ్లేషణను ప్రారంభించడానికి మూడు వేర్వేరు పద్ధతులను ఉపయోగించవచ్చు మరియు ప్రతి పద్ధతి యొక్క సాపేక్ష విశిష్టత cDNA సంశ్లేషణ మొత్తం మరియు రకాన్ని ప్రభావితం చేస్తుంది.

రాండమ్ ప్రైమర్ పద్ధతి మూడు పద్ధతుల్లో అతి తక్కువ నిర్దిష్టమైనది.చిన్న, పాక్షిక పొడవు cDNAని ఉత్పత్తి చేయడానికి ట్రాన్‌స్క్రిప్ట్ అంతటా అనేక సైట్‌లలో ప్రైమర్‌లు అనీల్ చేయబడతాయి.ఈ పద్ధతి తరచుగా 5′ టెర్మినల్ సీక్వెన్స్‌లు మరియు cDNAని RNA టెంప్లేట్‌ల నుండి సెకండరీ స్ట్రక్చరల్ రీజియన్‌లతో లేదా రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ రెప్లికేట్ చేయలేని టెర్మినేటింగ్ సైట్‌లతో పొందేందుకు ఉపయోగించబడుతుంది.పొడవైన cDNAని పొందేందుకు, ప్రతి RNA నమూనాలో ప్రైమర్‌ల నిష్పత్తిని RNAకి అనుభావికంగా నిర్ణయించాలి.యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్‌ల ప్రారంభ సాంద్రత 20μl ప్రతిచర్య వ్యవస్థకు 50 నుండి 250ng వరకు ఉంటుంది.యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి మొత్తం RNA నుండి సంశ్లేషణ చేయబడిన cDNA ప్రధానంగా రైబోసోమల్ RNA అయినందున, పాలీ(A)+RNA సాధారణంగా టెంప్లేట్‌గా ఎంపిక చేయబడుతుంది.

యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్‌ల కంటే ఒలిగో(dT) దీక్ష మరింత నిర్దిష్టంగా ఉంటుంది.ఇది చాలా యూకారియోటిక్ కణాలలో mRNA యొక్క 3′ ముగింపులో కనిపించే పాలీ(A) తోకతో సంకరం చెందుతుంది.పాలీ(A)+RNA మొత్తం RNAలో దాదాపు 1% నుండి 2% ఉన్నందున, cDNA మొత్తం మరియు సంక్లిష్టత యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించిన దానికంటే చాలా తక్కువగా ఉంటుంది.దాని అధిక నిర్దిష్టత కారణంగా, ఒలిగో(dT)కి సాధారణంగా RNA నుండి ప్రైమర్ నిష్పత్తి మరియు పాలీ(A)+ ఎంపిక కోసం ఆప్టిమైజేషన్ అవసరం లేదు.20μl ప్రతిచర్య వ్యవస్థకు 0.5μg ఒలిగో(dT)ని ఉపయోగించమని సిఫార్సు చేయబడింది.ఒలిగో(dT)12-18 చాలా RT-PCRకి అనుకూలంగా ఉంటుంది.థర్మోస్క్రిప్ట్ RT-PCR సిస్టమ్ దాని మంచి ఉష్ణ స్థిరత్వం కారణంగా ఒలిగో(dT)20ని అందిస్తుంది మరియు అధిక హోల్డింగ్ ఉష్ణోగ్రతలకు అనుకూలంగా ఉంటుంది.

జన్యు-నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌లు (GSP) రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ స్టెప్‌కి అత్యుత్తమ నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌లు.GSP అనేది యాంటిసెన్స్ ఒలిగోన్యూక్లియోసైడ్, ఇది యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్‌లు లేదా ఒలిగో(dT) వంటి అన్ని Rnaలను అనీల్ చేయడం కంటే ప్రత్యేకంగా RNA గమ్యస్థాన శ్రేణులతో హైబ్రిడైజ్ చేయగలదు.PCR ప్రైమర్‌లను రూపొందించడానికి ఉపయోగించే నియమాలు రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ రియాక్షన్ GSP రూపకల్పనకు కూడా వర్తిస్తాయి.GSP అనేది mRNA3′ చివరలో ఉన్న యాంప్లిఫికేషన్ ప్రైమర్ వలె అదే క్రమాన్ని కలిగి ఉంటుంది లేదా GSPని రివర్స్ యాంప్లిఫికేషన్ ప్రైమర్‌తో దిగువకు వచ్చేలా రూపొందించవచ్చు.కొన్ని యాంప్లిఫైడ్ ఆబ్జెక్ట్‌ల కోసం, విజయవంతమైన RT-PCR కోసం ఒకటి కంటే ఎక్కువ యాంటిసెన్స్ ప్రైమర్‌లను రూపొందించడం అవసరం ఎందుకంటే టార్గెట్ RNA యొక్క ద్వితీయ నిర్మాణం ప్రైమర్‌ను బైండింగ్ చేయకుండా నిరోధించవచ్చు.20μl యొక్క మొదటి చైన్ సింథసిస్ రియాక్షన్ సిస్టమ్‌లో 1pmol యాంటిసెన్స్ GSPని ఉపయోగించమని సూచించబడింది.

2. రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ యొక్క ఉష్ణ సంరక్షణ ఉష్ణోగ్రతను పెంచండి:

GSP నిర్దిష్టత యొక్క పూర్తి ప్రయోజనాన్ని పొందడానికి, అధిక ఉష్ణ స్థిరత్వం కలిగిన రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్‌ని ఉపయోగించాలి.ప్రతిచర్య దృఢత్వాన్ని పెంచడానికి వేడి-స్థిరమైన రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్‌ను అధిక ఉష్ణోగ్రతల వద్ద ఇన్సులేట్ చేయవచ్చు.ఉదాహరణకు, GSP 55°C వద్ద అనీల్ చేయబడితే, AMV లేదా M-MLVని ఉపయోగించి తక్కువ కఠినతతో 37°C వద్ద రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ చేస్తే GSP యొక్క నిర్దిష్టత పూర్తిగా ఉపయోగించబడదు.అయినప్పటికీ, SuperScripⅡ మరియు ThermoScriptలు 50℃ లేదా అంతకంటే ఎక్కువ వద్ద ప్రతిస్పందిస్తాయి, ఇది తక్కువ ఉష్ణోగ్రతల వద్ద ఉత్పత్తి చేయబడిన నిర్దిష్ట ఉత్పత్తులను తొలగిస్తుంది.గరిష్ట విశిష్టత కోసం, RNA/ ప్రైమర్ మిశ్రమాన్ని నేరుగా 65℃ డీనాటరేషన్ ఉష్ణోగ్రత నుండి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ హోల్డింగ్ ఉష్ణోగ్రతకు ప్రీహీటెడ్ 2 x రియాక్షన్ మిశ్రమం (సిడిఎన్‌ఎ సంశ్లేషణ యొక్క థర్మల్ ఇనిషియేషన్) జోడించడం ద్వారా బదిలీ చేయవచ్చు.ఇది తక్కువ ఉష్ణోగ్రతల వద్ద అణువుల మధ్య బేస్ జత చేయడాన్ని నిరోధించడంలో సహాయపడుతుంది.PCR పరికరాన్ని ఉపయోగించడం RT-PCR కోసం అవసరమైన అనేక ఉష్ణోగ్రత పరివర్తనలను సులభతరం చేస్తుంది.

3. జన్యుసంబంధమైన DNA కాలుష్యాన్ని తగ్గించండి:

RT-PCR తో ఒక సంభావ్య కష్టం ఏమిటంటే, RNA జన్యుసంబంధమైన DNAని కలుషితం చేస్తుంది.ట్రైజోల్ రీజెంట్ వంటి మెరుగైన RNA వేరుచేసే పద్ధతులను ఉపయోగించడం, RNA తయారీలలో జన్యుసంబంధమైన DNA కాలుష్యాన్ని తగ్గిస్తుంది.జన్యుసంబంధమైన DNA నుండి ఉత్పత్తి చేయబడిన ఉత్పత్తులను నివారించడానికి, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌కు ముందు కలుషితమైన DNAని తొలగించడానికి RNAను యాంప్లిఫికేషన్ గ్రేడ్ DnasⅠతో చికిత్స చేయవచ్చు.DNaseⅠ జీర్ణక్రియను ముగించడానికి నమూనాలను 10 నిమిషాల పాటు 2.0mM EDTAలో 65℃ వద్ద ఉంచారు.అధిక ఉష్ణోగ్రతల వద్ద సంభవించే మెగ్నీషియం అయాన్ ఆధారిత RNA జలవిశ్లేషణను నిరోధించడానికి EDTA మెగ్నీషియం అయాన్లను చీలేట్ చేస్తుంది.

జీనోమ్ DNA యాంప్లిఫికేషన్ ప్రొడక్ట్ నుండి యాంప్లిఫైడ్ cDNAని వేరు చేయడానికి, వేరు చేయబడిన ఎక్సాన్‌తో విడిగా ఎనియల్ చేసే ప్రైమర్‌లను రూపొందించవచ్చు.cDNA నుండి తీసుకోబడిన PCR ఉత్పత్తులు కలుషితమైన జన్యుసంబంధమైన DNA నుండి తీసుకోబడిన వాటి కంటే తక్కువగా ఉంటాయి.ప్రతి RNA టెంప్లేట్‌లో రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ లేకుండా ఒక నియంత్రిత ప్రయోగం కూడా నిర్వహించబడుతుంది, ఇచ్చిన భాగం జన్యుసంబంధమైన DNA లేదా cDNA నుండి వచ్చిందో లేదో నిర్ధారించడానికి.రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ లేనప్పుడు పొందిన PCR ఉత్పత్తులు జన్యువు నుండి తీసుకోబడ్డాయి.

సంబంధిత ఉత్పత్తి

RT-PCR సులభం^ᵀᴹనేను (ఒక అడుగు)

-ఒక-దశ కిట్ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ మరియు PCRని ఒకే ట్యూబ్‌లో నిర్వహించేలా చేస్తుంది.దీనికి టెంప్లేట్ RNA, నిర్దిష్ట PCR ప్రైమర్‌లు మరియు RNase-Free ddH మాత్రమే జోడించాలి₂O.

-ఆర్‌ఎన్‌ఏ యొక్క నిజ-సమయ పరిమాణాత్మక విశ్లేషణ త్వరగా మరియు ఖచ్చితంగా నిర్వహించబడుతుంది.

-కిట్ ఒక ప్రత్యేకమైన ఫోర్జీన్ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ రియాజెంట్ మరియు రియాక్షన్ యొక్క యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని మరియు నిర్దిష్టతను ప్రభావవంతంగా మెరుగుపరచడానికి ప్రత్యేకమైన రియాక్షన్ సిస్టమ్‌తో కలిపి ఫోర్‌జీన్ హాట్‌స్టార్ టాక్ DNA పాలిమరేస్‌ను ఉపయోగిస్తుంది.

-ఆప్టిమైజ్డ్ రియాక్షన్ సిస్టమ్ రియాక్షన్‌కి అధిక గుర్తింపు సున్నితత్వం, బలమైన ఉష్ణ స్థిరత్వం మరియు మెరుగైన సహనం కలిగి ఉండేలా చేస్తుంది.

GDNaseతో రియల్ టైమ్ PCR కోసం ఫస్ట్-స్ట్రాండ్ CDNA సింథసిస్ కోసం RT ఈజీ II(GDNaseతో) మాస్టర్ ప్రీమిక్స్

-2 నిమిషాల్లో టెంప్లేట్‌లోని gDNAని తీసివేయగలిగే gDNAని తొలగించగల సమర్థ సామర్థ్యం.

-సమర్థవంతమైన రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సిస్టమ్, మొదటి స్ట్రాండ్ cDNA సంశ్లేషణను పూర్తి చేయడానికి 15 నిమిషాలు మాత్రమే పడుతుంది.

-కాంప్లెక్స్ టెంప్లేట్‌లు: అధిక GC కంటెంట్ మరియు కాంప్లెక్స్ సెకండరీ స్ట్రక్చర్ ఉన్న టెంప్లేట్‌లను కూడా అధిక సామర్థ్యంతో రివర్స్ చేయవచ్చు.

-హై-సెన్సిటివిటీ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సిస్టమ్, pg-స్థాయి టెంప్లేట్‌లు కూడా అధిక-నాణ్యత cDNAని పొందవచ్చు.

-రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సిస్టమ్ అధిక ఉష్ణ స్థిరత్వాన్ని కలిగి ఉంది, సరైన ప్రతిచర్య ఉష్ణోగ్రత 42℃, మరియు ఇది ఇప్పటికీ 50℃ వద్ద మంచి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ పనితీరును కలిగి ఉంది.