అవలోకనం
జన్యుమార్పిడి మొక్కల వేగవంతమైన గుర్తింపు
టెక్స్ట్/టాంగ్ యుచెంగ్
ప్రయోగాత్మక ఆపరేషన్/హాన్ యింగ్
ఎడిటర్/వెన్ యూజున్
పదాలు/1600+
సూచించబడిన పఠన సమయం/8-10 నిమిషాలు
జన్యుమార్పిడి మొక్కల వేగవంతమైన గుర్తింపు
ప్రయోగశాలలో కొత్తగా వచ్చిన వ్యక్తిగా, తక్కువ మార్పిడి రేటు ఉన్న మొక్కల సమూహం నుండి సానుకూల మొక్కలను పరీక్షించడం మంచి పని కాదు.ముందుగా, DNAను పెద్ద సంఖ్యలో నమూనాల నుండి ఒక్కొక్కటిగా సేకరించాలి, ఆపై విదేశీ జన్యువులు PCR ద్వారా కనుగొనబడతాయి.అయినప్పటికీ, ఫలితాలు తరచుగా ఖాళీలు మరియు బ్యాండ్‌లు అప్పుడప్పుడు కొన్ని ఐటెమ్‌లతో ఉంటాయి, కానీ మిస్ డిటెక్షన్‌లు లేదా తప్పుడు గుర్తింపులు ఉన్నాయో లేదో గుర్తించడం అసాధ్యం..అటువంటి ప్రయోగాత్మక ప్రక్రియ మరియు ఫలితాలను ఎదుర్కోవడం చాలా నిస్సహాయంగా ఉందా?చింతించకండి, జన్యుమార్పిడి సానుకూల మొక్కలను సులభంగా మరియు ఖచ్చితంగా ఎలా పరీక్షించాలో సోదరుడు మీకు నేర్పిస్తున్నాడు.
దశ 1: డిజైన్ డిటెక్షన్ ప్రైమర్‌లు
పరీక్షించాల్సిన నమూనా ప్రకారం ఎండోజెనస్ జన్యువు మరియు ఎక్సోజనస్ జన్యువును గుర్తించండి మరియు ప్రైమర్ డిజైన్ కోసం జన్యువులోని ప్రతినిధి 100-500bp క్రమాన్ని ఎంచుకోండి.మంచి ప్రైమర్‌లు గుర్తింపు ఫలితాల యొక్క ఖచ్చితత్వాన్ని నిర్ధారిస్తాయి మరియు గుర్తించే సమయాన్ని తగ్గించగలవు (సాధారణంగా ఉపయోగించే డిటెక్షన్ ప్రైమర్‌ల కోసం అనుబంధాన్ని చూడండి).
గమనిక:
కొత్తగా రూపొందించిన ప్రైమర్‌లు ప్రతిచర్య పరిస్థితులను ఆప్టిమైజ్ చేయాలి మరియు పెద్ద-స్థాయి గుర్తింపును ప్రదర్శించే ముందు గుర్తింపు యొక్క ఖచ్చితత్వం, ఖచ్చితత్వం మరియు గుర్తింపు పరిమితిని ధృవీకరించాలి.
దశ 2:ప్రయోగాత్మక ప్రోటోకాల్‌ను అభివృద్ధి చేయండి
సానుకూల నియంత్రణ: PCR ప్రతిచర్య వ్యవస్థ మరియు పరిస్థితులు సాధారణంగా ఉన్నాయో లేదో తెలుసుకోవడానికి లక్ష్య భాగాన్ని కలిగి ఉన్న శుద్ధి చేయబడిన DNAని టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించండి.
ప్రతికూల/ఖాళీ నియంత్రణ: DNA టెంప్లేట్ లేదా ddH ఉపయోగించండి2PCR సిస్టమ్‌లో కాలుష్యం యొక్క మూలం ఉందో లేదో గుర్తించడానికి లక్ష్య భాగాన్ని టెంప్లేట్‌గా కలిగి ఉండని O.
అంతర్గత సూచన నియంత్రణ: PCR ద్వారా టెంప్లేట్‌ను గుర్తించవచ్చో లేదో విశ్లేషించడానికి పరీక్షించాల్సిన నమూనా యొక్క అంతర్జాత జన్యువు యొక్క ప్రైమర్/ప్రోబ్ కలయికను ఉపయోగించండి.
గమనిక:
ప్రయోగాత్మక ఫలితాల యొక్క ప్రామాణికతను అంచనా వేయడానికి ప్రతి పరీక్షకు సానుకూల, ప్రతికూల/ఖాళీ నియంత్రణలు మరియు అంతర్గత నియంత్రణ నియంత్రణలు సెట్ చేయబడాలి.
దశ 3: ప్రయోగ తయారీ
ఉపయోగం ముందు, పరిష్కారం సమానంగా మిశ్రమంగా ఉందో లేదో గమనించండి.అవపాతం కనుగొనబడితే, ఉపయోగం ముందు సూచనల ప్రకారం దానిని కరిగించి కలపాలి.2×PCR మిశ్రమాన్ని అసమాన అయాన్ పంపిణీని నివారించడానికి ఉపయోగించే ముందు మైక్రోపిపెట్‌తో పైపెట్ చేసి పదేపదే కలపాలి.
గమనిక:
సూచనలను తీసివేసి, వాటిని జాగ్రత్తగా చదవండి మరియు సూచనలతో ఖచ్చితమైన అనుగుణంగా ప్రయోగానికి ముందు సన్నాహాలు చేయండి.
దశ 4: PCR ప్రతిచర్య వ్యవస్థను సిద్ధం చేయండి
ప్రయోగాత్మక ప్రోటోకాల్ ప్రకారం, ప్రైమర్‌లను కలపండి, H2O, 2×PCR మిక్స్, సెంట్రిఫ్యూజ్ మరియు వాటిని ప్రతి రియాక్షన్ ట్యూబ్‌కి పంపిణీ చేయండి.
గమనిక:
పెద్ద-స్థాయి లేదా దీర్ఘకాలిక పరీక్ష కోసం, UNG ఎంజైమ్‌ను కలిగి ఉన్న PCR ప్రతిచర్య వ్యవస్థను ఉపయోగించమని సిఫార్సు చేయబడింది, ఇది PCR ఉత్పత్తుల వల్ల కలిగే ఏరోసోల్ కాలుష్యాన్ని సమర్థవంతంగా నివారించగలదు.
దశ 5: ప్రతిచర్య టెంప్లేట్‌ను జోడించండి
డైరెక్ట్ PCR సాంకేతికతను ఉపయోగించి, దుర్భరమైన న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ శుద్దీకరణ ప్రక్రియ అవసరం లేదు.నమూనా టెంప్లేట్‌ను 10 నిమిషాల్లో తయారు చేయవచ్చు మరియు సంబంధిత PCR ప్రతిచర్య వ్యవస్థకు జోడించవచ్చు.
గమనిక:
లైసిస్ పద్ధతి మెరుగైన గుర్తింపు ప్రభావాన్ని కలిగి ఉంటుంది మరియు పొందిన ఉత్పత్తిని బహుళ గుర్తింపు ప్రతిచర్యలకు ఉపయోగించవచ్చు.
5.1: ఆకుల ప్రత్యక్ష PCR
మాన్యువల్‌లోని చిత్రం పరిమాణం ప్రకారం, 2-3 మిమీ వ్యాసంతో ఆకు కణజాలాన్ని కత్తిరించండి మరియు PCR ప్రతిచర్య వ్యవస్థలో ఉంచండి.
గమనిక: ఆకు శకలాలు PCR ప్రతిచర్య ద్రావణంలో పూర్తిగా మునిగిపోయాయని నిర్ధారించుకోండి మరియు అధిక ఆకు కణజాలాన్ని జోడించవద్దు.
5.2: లీఫ్ లిసిస్ పద్ధతి
5-7 మిమీ వ్యాసంతో ఆకు కణజాలాన్ని కత్తిరించి సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లో ఉంచండి.మీరు పరిపక్వ ఆకులను ఎంచుకుంటే, దయచేసి ఆకు యొక్క ప్రధాన సిరలోని కణజాలాలను ఉపయోగించకుండా ఉండండి.పైపెట్ 50ul బఫర్ P1 సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లోకి లైసేట్ లైసేట్ ఆకు కణజాలాన్ని పూర్తిగా ముంచి, థర్మల్ సైక్లర్ లేదా మెటల్ బాత్‌లో ఉంచి, 95°C వద్ద 5-10 నిమిషాల పాటు లైస్ చేస్తుంది.
50ul బఫర్ P2 న్యూట్రలైజేషన్ సొల్యూషన్ వేసి బాగా కలపండి.ఫలితంగా లైసేట్‌ను టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించవచ్చు మరియు PCR ప్రతిచర్య వ్యవస్థకు జోడించవచ్చు.
గమనిక: టెంప్లేట్ మొత్తం PCR సిస్టమ్‌లో 5-10% మధ్య ఉండాలి మరియు 20% మించకూడదు (ఉదాహరణకు, 20μl PCR సిస్టమ్‌లో, 1-2μl లైసిస్ బఫర్‌ని జోడించండి, 4μl కంటే ఎక్కువ కాదు).
దశ 6: PCR ప్రతిచర్య
PCR రియాక్షన్ ట్యూబ్‌ను సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసిన తర్వాత, వాటిని యాంప్లిఫికేషన్ కోసం PCR పరికరంలో ఉంచండి.
గమనిక:
ప్రతిచర్య యాంప్లిఫికేషన్ కోసం నాన్-ప్యూరిఫైడ్ టెంప్లేట్‌ను ఉపయోగిస్తుంది, కాబట్టి యాంప్లిఫికేషన్ సైకిల్స్ సంఖ్య శుద్ధి చేయబడిన DNA టెంప్లేట్‌ని ఉపయోగిస్తున్నప్పుడు కంటే 5-10 ఎక్కువ సైకిళ్లను కలిగి ఉంటుంది.
దశ 7: ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ గుర్తింపు మరియు ఫలితాల విశ్లేషణ
M: 100bp DNA నిచ్చెన
1\4: శుద్ధి చేయబడిన DNA పద్ధతి
2\5: డైరెక్ట్ PCR పద్ధతి
3\6: ఖాళీ నియంత్రణ
నాణ్యత నియంత్రణ:
ప్రయోగంలో సెట్ చేయబడిన వివిధ నియంత్రణల పరీక్ష ఫలితాలు క్రింది షరతులకు అనుగుణంగా ఉండాలి.లేకపోతే, సమస్య యొక్క కారణాన్ని విశ్లేషించాలి మరియు సమస్య తొలగించబడిన తర్వాత పరీక్షను మళ్లీ నిర్వహించాలి.
టేబుల్ 1. వివిధ నియంత్రణ సమూహాల సాధారణ పరీక్ష ఫలితాలు
*ప్లాస్మిడ్‌ను సానుకూల నియంత్రణగా ఉపయోగించినప్పుడు, అంతర్జాత జన్యు పరీక్ష ఫలితం ప్రతికూలంగా ఉంటుంది
ఫలితం తీర్పు:
A. నమూనా యొక్క అంతర్జాత జన్యువు యొక్క పరీక్ష ఫలితం ప్రతికూలంగా ఉంది, ఇది సాధారణ PCR గుర్తింపుకు అనువైన DNA నమూనా నుండి సంగ్రహించబడదని లేదా సేకరించిన DNA PCR ప్రతిచర్య నిరోధకాలను కలిగి ఉందని సూచిస్తుంది మరియు DNA మళ్లీ సంగ్రహించబడాలి.
B. నమూనా యొక్క అంతర్జాత జన్యువు యొక్క పరీక్ష ఫలితం సానుకూలంగా ఉంటుంది మరియు బాహ్య జన్యువు యొక్క పరీక్ష ఫలితం ప్రతికూలంగా ఉంటుంది, ఇది సాధారణ PCR గుర్తింపుకు తగిన DNA నమూనా నుండి సంగ్రహించబడిందని సూచిస్తుంది మరియు XXX జన్యువు నమూనాలో గుర్తించబడలేదని నిర్ధారించవచ్చు.
C. నమూనా యొక్క అంతర్జాత జన్యువు యొక్క పరీక్ష ఫలితం సానుకూలంగా ఉంటుంది మరియు బాహ్య జన్యువు యొక్క పరీక్ష ఫలితం సానుకూలంగా ఉంటుంది, ఇది సాధారణ PCR గుర్తింపుకు తగిన DNA నమూనా నుండి సంగ్రహించబడిందని మరియు నమూనా DNA XXX జన్యువును కలిగి ఉందని సూచిస్తుంది.నిర్ధారణ ప్రయోగాలను మరింతగా నిర్వహించవచ్చు.
దశ 8: డిజైన్ డిటెక్షన్ ప్రైమర్‌లు
ప్రయోగం తర్వాత, పర్యావరణ కాలుష్యాన్ని నివారించడానికి ప్రయోగాత్మక ప్రాంతాన్ని తుడవడానికి 2% సోడియం హైపోక్లోరైట్ ద్రావణం మరియు 70% ఇథనాల్ ద్రావణాన్ని ఉపయోగించండి.
అపెండిక్స్
పట్టిక 2. జన్యుపరంగా మార్పు చెందిన మొక్కల సాధారణ PCR గుర్తింపు కోసం సాధారణంగా ఉపయోగించే ప్రైమర్‌లు
సూచన పత్రం:
SN/T 1202-2010, ఆహారంలో జన్యుపరంగా మార్పు చెందిన మొక్కల పదార్థాల కోసం గుణాత్మక PCR గుర్తింపు పద్ధతి.
వ్యవసాయ మంత్రిత్వ శాఖ ప్రకటన 1485-5-2010, జన్యుపరంగా మార్పు చెందిన మొక్కల పదార్థాలు మరియు వాటి ఉత్పత్తులు-బియ్యం M12 మరియు దాని ఉత్పన్నాల పరీక్ష.
పోస్ట్ సమయం: జూన్-09-2021
