RT-qPCR సాధారణ PCR సాంకేతికత నుండి అభివృద్ధి చేయబడింది.ఇది సాంప్రదాయ PCR ప్రతిచర్య వ్యవస్థకు ఫ్లోరోసెంట్ రసాయనాలను (ఫ్లోరోసెంట్ డైస్ లేదా ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్స్) జోడిస్తుంది మరియు PCR ఎనియలింగ్ మరియు ఎక్స్‌టెన్షన్ ప్రక్రియను వాటి విభిన్న ప్రకాశించే యంత్రాంగాల ప్రకారం నిజ సమయంలో గుర్తిస్తుంది.మీడియంలోని ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్ మార్పులు PCR యొక్క ప్రతి చక్రంలో ఉత్పత్తి మార్పు మొత్తాన్ని లెక్కించడానికి ఉపయోగించబడతాయి.ప్రస్తుతం, అత్యంత సాధారణ పద్ధతులు ఫ్లోరోసెంట్ డై పద్ధతి మరియు ప్రోబ్ పద్ధతి.

ఫ్లోరోసెంట్ డై పద్ధతి:
SYBR గ్రీన్ Ⅰ, PicoGreen, BEBO మొదలైన కొన్ని ఫ్లోరోసెంట్ రంగులు తమంతట తాముగా కాంతిని విడుదల చేయవు, కానీ dsDNA యొక్క చిన్న గాడితో బంధించిన తర్వాత ఫ్లోరోసెన్స్‌ను విడుదల చేస్తాయి.అందువల్ల, PCR ప్రతిచర్య ప్రారంభంలో, యంత్రం ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్‌ను గుర్తించదు.ప్రతిచర్య ఎనియలింగ్-ఎక్స్‌టెన్షన్ (రెండు-దశల పద్ధతి) లేదా పొడిగింపు దశ (మూడు-దశల పద్ధతి)కి వెళ్లినప్పుడు, ఈ సమయంలో డబుల్ స్ట్రాండ్‌లు తెరవబడతాయి మరియు కొత్త DNA పాలిమరేస్ స్ట్రాండ్ సంశ్లేషణ సమయంలో, ఫ్లోరోసెంట్ అణువులు dsDNA మైనర్ గాడిలో మిళితం చేయబడతాయి మరియు ఫ్లోరోసెన్స్‌ను విడుదల చేస్తాయి.PCR చక్రాల సంఖ్య పెరిగేకొద్దీ, మరింత ఎక్కువ రంగులు dsDNAతో కలిసిపోతాయి మరియు ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్ కూడా నిరంతరం మెరుగుపరచబడుతుంది.SYBR గ్రీన్ Ⅰని ఉదాహరణగా తీసుకోండి.
విచారణ పద్ధతి:
తక్మాన్ ప్రోబ్ అనేది సాధారణంగా ఉపయోగించే జలవిశ్లేషణ ప్రోబ్.ప్రోబ్ యొక్క 5′ చివరలో ఫ్లోరోసెంట్ సమూహం ఉంటుంది, సాధారణంగా FAM.ప్రోబ్ అనేది లక్ష్య జన్యువుకు పరిపూరకరమైన క్రమం.ఫ్లోరోఫోర్ యొక్క 3′ చివరలో ఫ్లోరోసెంట్ క్వెన్చింగ్ గ్రూప్ ఉంది.ఫ్లోరోసెన్స్ రెసొనెన్స్ ఎనర్జీ ట్రాన్స్‌ఫర్ (Förster రెసొనెన్స్ ఎనర్జీ ట్రాన్స్‌ఫర్, FRET) సూత్రం ప్రకారం, రిపోర్టర్ ఫ్లోరోసెంట్ గ్రూప్ (దాత ఫ్లోరోసెంట్ మాలిక్యూల్) మరియు క్వెన్చింగ్ ఫ్లోరోసెంట్ గ్రూప్ (అసెప్టర్ ఫ్లోరోసెంట్ మాలిక్యూల్) ఉన్నప్పుడు ఉత్తేజిత స్పెక్ట్రమ్ అతివ్యాప్తి చెందినప్పుడు, 7 దూరం చాలా దగ్గరగా ఉంటుంది. అంగీకార అణువు యొక్క ఫ్లోరోసెన్స్, అయితే ఆటోఫ్లోరోసెన్స్ బలహీనపడుతుంది.అందువల్ల, PCR ప్రతిచర్య ప్రారంభంలో, ప్రోబ్ వ్యవస్థలో ఉచితంగా మరియు చెక్కుచెదరకుండా ఉన్నప్పుడు, రిపోర్టర్ ఫ్లోరోసెంట్ సమూహం ఫ్లోరోసెన్స్‌ను విడుదల చేయదు.ఎనియలింగ్ చేసినప్పుడు, ప్రైమర్ మరియు ప్రోబ్ టెంప్లేట్‌కు కట్టుబడి ఉంటాయి.పొడిగింపు దశలో, పాలిమరేస్ నిరంతరం కొత్త గొలుసులను సంశ్లేషణ చేస్తుంది.DNA పాలిమరేస్ 5′-3′ ఎక్సోన్యూకలీస్ కార్యాచరణను కలిగి ఉంది.ప్రోబ్‌కు చేరుకున్నప్పుడు, DNA పాలిమరేస్ టెంప్లేట్ నుండి ప్రోబ్‌ను హైడ్రోలైజ్ చేస్తుంది, రిపోర్టర్ ఫ్లోరోసెంట్ సమూహాన్ని క్వెన్చర్ ఫ్లోరోసెంట్ గ్రూప్ నుండి వేరు చేస్తుంది మరియు ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్‌ను విడుదల చేస్తుంది.ప్రోబ్ మరియు టెంప్లేట్ మధ్య ఒకదానికొకటి సంబంధం ఉన్నందున, పరీక్ష యొక్క ఖచ్చితత్వం మరియు సున్నితత్వం పరంగా డై పద్ధతి కంటే ప్రోబ్ పద్ధతి గొప్పది.

qRT-PCR యొక్క అంజీర్ 1 సూత్రం

ప్రైమర్ డిజైన్
సూత్రాలు:

ప్రైమర్‌లు న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ సిరీస్‌లోని సంరక్షించబడిన ప్రాంతంలో రూపొందించబడాలి మరియు నిర్దిష్టతను కలిగి ఉండాలి.

cDNA సీక్వెన్స్‌ని ఉపయోగించడం ఉత్తమం మరియు mRNA సీక్వెన్స్ కూడా ఆమోదయోగ్యమైనది.కాకపోతే, DNA సీక్వెన్స్ యొక్క cds రీజియన్ డిజైన్‌ను కనుగొనండి.
ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ ఉత్పత్తి యొక్క పొడవు 80-150bp, పొడవైనది 300bp, ప్రైమర్ పొడవు సాధారణంగా 17-25 బేస్‌ల మధ్య ఉంటుంది మరియు అప్‌స్ట్రీమ్ మరియు డౌన్‌స్ట్రీమ్ ప్రైమర్‌ల మధ్య వ్యత్యాసం చాలా పెద్దదిగా ఉండకూడదు.

G+C కంటెంట్ 40% మరియు 60% మధ్య ఉంది మరియు 45-55% ఉత్తమమైనది.
TM విలువ 58-62 డిగ్రీల మధ్య ఉంటుంది.
ప్రైమర్ డైమర్‌లు మరియు సెల్ఫ్-డైమర్‌లను నివారించడానికి ప్రయత్నించండి, (వరుసగా 4 జతల కంటే ఎక్కువ కాంప్లిమెంటరీ బేస్‌లు కనిపించవు) హెయిర్‌పిన్ నిర్మాణం, అనివార్యమైతే, ΔG<4.5kJ/mol* చేయండి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సమయంలో gDNA తీసివేయబడిందని మీరు నిర్ధారించుకోలేకపోతే, క్లీన్, రిచ్, రీజియన్ యొక్క ప్రైమర్‌లను రూపొందించడం ఉత్తమం. T/C, A/G నిరంతర నిర్మాణం (2-3) ప్రైమర్‌లు మరియు నాన్-
నిర్దిష్ట వైవిధ్యంగా విస్తరించిన శ్రేణి యొక్క హోమోలజీ 70% కంటే తక్కువగా ఉంటుంది లేదా 8 కాంప్లిమెంటరీ బేస్ హోమోలజీని కలిగి ఉంటుంది.
డేటాబేస్:
CottonFGD కీలక పదాల ద్వారా శోధించండి
ప్రైమర్ డిజైన్:
IDT-qPCR ప్రైమర్ డిజైన్

Fig2 IDT ఆన్‌లైన్ ప్రైమర్ డిజైన్ టూల్ పేజీ

Fig3 ఫలితం పేజీ ప్రదర్శన
lncRNA ప్రైమర్‌ల రూపకల్పన:
lncRNA:mRNA వలె అదే దశలు.
miRNA:స్టెమ్-లూప్ పద్ధతి యొక్క సూత్రం: అన్ని miRNAలు దాదాపు 23 ntల చిన్న సీక్వెన్సులు కాబట్టి, డైరెక్ట్ PCR డిటెక్షన్ చేయడం సాధ్యం కాదు, కాబట్టి స్టెమ్-లూప్ సీక్వెన్స్ టూల్ ఉపయోగించబడుతుంది.స్టెమ్-లూప్ సీక్వెన్స్ అనేది దాదాపు 50 nt యొక్క ఒక సింగిల్ స్ట్రాండెడ్ DNA, ఇది స్వయంగా హెయిర్‌పిన్ నిర్మాణాన్ని ఏర్పరుస్తుంది.3 'ముగాన్ని miRNA పాక్షిక ఫ్రాగ్‌మెంట్‌కు పరిపూరకరమైన సీక్వెన్స్‌గా రూపొందించవచ్చు, ఆపై లక్ష్య miRNAని రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సమయంలో స్టెమ్-లూప్ సీక్వెన్స్‌కు కనెక్ట్ చేయవచ్చు మరియు మొత్తం పొడవు 70bpకి చేరుకుంటుంది, ఇది qPCR ద్వారా నిర్ణయించబడిన విస్తరించిన ఉత్పత్తి పొడవుకు అనుగుణంగా ఉంటుంది.టైలింగ్ miRNA ప్రైమర్ డిజైన్.
యాంప్లిఫికేషన్-నిర్దిష్ట గుర్తింపు:
ఆన్‌లైన్ బ్లాస్ట్ డేటాబేస్: సీక్వెన్స్ సారూప్యత ద్వారా CottonFGD బ్లాస్ట్
లోకల్ బ్లాస్ట్: లోకల్ బ్లాస్ట్ చేయడానికి Blast+ని ఉపయోగించడాన్ని చూడండి, linux మరియు macos నేరుగా స్థానిక డేటాబేస్‌ను ఏర్పాటు చేసుకోవచ్చు, ఉబుంటు బాష్‌ని ఇన్‌స్టాల్ చేసిన తర్వాత win10 సిస్టమ్ కూడా చేయవచ్చు.స్థానిక పేలుడు డేటాబేస్ మరియు స్థానిక పేలుడును సృష్టించండి;win10లో ఉబుంటు బాష్ తెరవండి.
నోటీసు: అప్‌ల్యాండ్ కాటన్ మరియు సీ ఐలాండ్ కాటన్ టెట్రాప్లాయిడ్ పంటలు, కాబట్టి పేలుడు ఫలితంగా తరచుగా రెండు లేదా అంతకంటే ఎక్కువ మ్యాచ్‌లు ఉంటాయి.గతంలో, బ్లాస్ట్ చేయడానికి NAU cdsని డేటాబేస్‌గా ఉపయోగించడం వలన కొన్ని SNP తేడాలు ఉన్న రెండు హోమోలాగస్ జన్యువులను కనుగొనే అవకాశం ఉంది.సాధారణంగా, రెండు హోమోలాగస్ జన్యువులను ప్రైమర్ డిజైన్ ద్వారా వేరు చేయలేము, కాబట్టి అవి ఒకే విధంగా పరిగణించబడతాయి.స్పష్టమైన ఇండెల్ ఉన్నట్లయితే, ప్రైమర్ సాధారణంగా ఇండెల్‌పై రూపొందించబడింది, అయితే ఇది ప్రైమర్ యొక్క ద్వితీయ నిర్మాణానికి దారితీయవచ్చు ఉచిత శక్తి అధికమవుతుంది, ఇది యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యంలో తగ్గుదలకు దారితీస్తుంది, కానీ ఇది అనివార్యం.

ప్రైమర్ సెకండరీ నిర్మాణాన్ని గుర్తించడం:
దశలు:ఓపెన్ ఒలిగో 7 → ఇన్‌పుట్ టెంప్లేట్ సీక్వెన్స్ → క్లోజ్ సబ్-విండో → సేవ్ → టెంప్లేట్‌లో ప్రైమర్‌ను గుర్తించండి, ప్రైమర్ పొడవును సెట్ చేయడానికి ctrl+D నొక్కండి → సెల్ఫ్-డైమెరైజేషన్ బాడీ, హెటెరోడైమర్, హెయిర్‌పిన్, అసమతుల్యత వంటి వివిధ సెకండరీ స్ట్రక్చర్‌లను విశ్లేషించండి. ఫిగర్ 4 యొక్క చివరి రెండు ఫలితాలు ప్రైమర్‌లలో ఉన్నాయి.ఫ్రంట్ ప్రైమర్ యొక్క ఫలితం మంచిది, స్పష్టమైన డైమర్ మరియు హెయిర్‌పిన్ నిర్మాణం లేదు, నిరంతర పరిపూరకరమైన స్థావరాలు లేవు మరియు ఉచిత శక్తి యొక్క సంపూర్ణ విలువ 4.5 కంటే తక్కువగా ఉంటుంది, అయితే వెనుక ప్రైమర్ నిరంతరం చూపిస్తుంది 6 బేస్‌లు పరిపూరకరమైనవి మరియు ఉచిత శక్తి 8.8;అదనంగా, 3′ ముగింపులో మరింత తీవ్రమైన డైమర్ కనిపిస్తుంది మరియు 4 వరుస బేస్‌ల డైమర్ కనిపిస్తుంది.ఉచిత శక్తి ఎక్కువగా లేనప్పటికీ, 3′ డైమర్ Chl యాంప్లిఫికేషన్ స్పెసిసిటీ మరియు యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని తీవ్రంగా ప్రభావితం చేస్తుంది.అదనంగా, హెయిర్‌పిన్‌లు, హెటెరోడైమర్‌లు మరియు అసమతుల్యతలను తనిఖీ చేయడం అవసరం.

Fig3 oligo7 గుర్తింపు ఫలితాలు
యాంప్లిఫికేషన్ ఎఫిషియన్సీ డిటెక్షన్:
PCR ప్రతిచర్య యొక్క విస్తరణ సామర్థ్యం PCR ఫలితాలను తీవ్రంగా ప్రభావితం చేస్తుంది.అలాగే qRT-PCRలో, పరిమాణాత్మక ఫలితాల కోసం యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం చాలా ముఖ్యమైనది.ప్రతిచర్య బఫర్‌లోని ఇతర పదార్థాలు, యంత్రాలు మరియు ప్రోటోకాల్‌లను తీసివేయండి.ప్రైమర్‌ల నాణ్యత కూడా qRT-PCR యొక్క యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యంపై గొప్ప ప్రభావాన్ని చూపుతుంది.ఫలితాల ఖచ్చితత్వాన్ని నిర్ధారించడానికి, సాపేక్ష ఫ్లోరోసెన్స్ క్వాంటిఫికేషన్ మరియు సంపూర్ణ ఫ్లోరోసెన్స్ క్వాంటిఫికేషన్ రెండూ ప్రైమర్‌ల యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని గుర్తించాలి.ప్రభావవంతమైన qRT-PCR యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం 85% మరియు 115% మధ్య ఉన్నట్లు గుర్తించబడింది.రెండు పద్ధతులు ఉన్నాయి:
1. ప్రామాణిక వక్రత పద్ధతి:
a.cDNA కలపండి
బి.ప్రవణత పలుచన
c.qPCR
డి.యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని లెక్కించడానికి లీనియర్ రిగ్రెషన్ ఈక్వేషన్
2. LinRegPCR
LinRegPCR అనేది నిజ సమయ RT-PCR డేటా యొక్క విశ్లేషణ కోసం ఒక ప్రోగ్రామ్, దీనిని SYBR గ్రీన్ లేదా సారూప్య రసాయన శాస్త్రం ఆధారంగా క్వాంటిటేటివ్ PCR (qPCR) డేటా అని కూడా పిలుస్తారు.ప్రోగ్రామ్ నాన్-బేస్‌లైన్ సరిదిద్దబడిన డేటాను ఉపయోగిస్తుంది, ప్రతి నమూనాపై విడిగా బేస్‌లైన్ కరెక్షన్ చేస్తుంది, విండో-ఆఫ్-లీనియారిటీని నిర్ణయిస్తుంది మరియు PCR డేటా సెట్ ద్వారా సరళ రేఖకు సరిపోయేలా లీనియర్ రిగ్రెషన్ విశ్లేషణను ఉపయోగిస్తుంది.ఈ రేఖ యొక్క వాలు నుండి ప్రతి వ్యక్తి నమూనా యొక్క PCR సామర్థ్యం లెక్కించబడుతుంది.యాంప్లికాన్‌కు సగటు PCR సామర్థ్యం మరియు నమూనాకు Ct విలువ ఒక నమూనాకు ప్రారంభ ఏకాగ్రతను లెక్కించడానికి ఉపయోగించబడుతుంది, ఇది ఏకపక్ష ఫ్లోరోసెన్స్ యూనిట్‌లలో వ్యక్తీకరించబడుతుంది.డేటా ఇన్‌పుట్ మరియు అవుట్‌పుట్ ఎక్సెల్ స్ప్రెడ్‌షీట్ ద్వారా అందించబడతాయి.నమూనా మాత్రమే
మిక్సింగ్ అవసరం, గ్రేడియంట్ లేదు
దశలు అవసరం:(బోల్ CFX96ని ఉదాహరణగా తీసుకోండి, స్పష్టమైన ABIతో మెషిన్ కాదు)
ప్రయోగం:ఇది ఒక ప్రామాణిక qPCR ప్రయోగం.
qPCR డేటా అవుట్‌పుట్:LinRegPCR అవుట్‌పుట్ ఫైల్‌ల యొక్క రెండు రూపాలను గుర్తించగలదు: RDML లేదా క్వాంటిఫికేషన్ యాంప్లిఫికేషన్ ఫలితం.వాస్తవానికి, ఇది యంత్రం ద్వారా సైకిల్ నంబర్ మరియు ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్ యొక్క నిజ-సమయ గుర్తింపు విలువ, మరియు లీనియర్ సెగ్మెంట్ సామర్థ్యం యొక్క ఫ్లోరోసెన్స్ మార్పు విలువను విశ్లేషించడం ద్వారా యాంప్లిఫికేషన్ పొందబడుతుంది.
డేటా ఎంపిక: సిద్ధాంతపరంగా, RDML విలువ ఉపయోగించదగినదిగా ఉండాలి.సాఫ్ట్‌వేర్ RDMLని గుర్తించలేకపోవడమే నా కంప్యూటర్ సమస్య అని అంచనా వేయబడింది, కాబట్టి నేను అసలు డేటాగా ఎక్సెల్ అవుట్‌పుట్ విలువను కలిగి ఉన్నాను.నమూనాలను జోడించడంలో వైఫల్యం మొదలైన డేటా యొక్క కఠినమైన స్క్రీనింగ్‌ని ముందుగా నిర్వహించాలని సిఫార్సు చేయబడింది. అవుట్‌పుట్ డేటాలో పాయింట్‌లను తొలగించవచ్చు (వాస్తవానికి, మీరు వాటిని తొలగించలేరు, LinRegPCR ఈ పాయింట్‌లను తరువాతి దశలో విస్మరిస్తుంది)

Fig5 qPCR డేటా ఎగుమతి

Fig6 అభ్యర్థి నమూనాల ఎంపిక

డేటా ఇన్‌పుట్:క్వాలిఫికేషన్ యాంప్లిఫికేషన్ ఫలితాలు.xls తెరవండి, → ఓపెన్ LinRegPCR → ఫైల్ → ఎక్సెల్ నుండి చదవండి → మూర్తి 7లో చూపిన విధంగా పారామితులను ఎంచుకోండి → సరే → బేస్‌లైన్‌లను నిర్ణయించు క్లిక్ చేయండి

linRegPCR డేటా ఇన్‌పుట్ యొక్క Fig7 దశలు

ఫలితం:పునరావృతం లేకపోతే, సమూహం అవసరం లేదు.పునరావృతం అయినట్లయితే, నమూనా సమూహంలో సమూహాన్ని సవరించవచ్చు మరియు ఐడెంటిఫైయర్‌లో జన్యువు పేరు నమోదు చేయబడుతుంది, ఆపై అదే జన్యువు స్వయంచాలకంగా సమూహం చేయబడుతుంది.చివరగా, ఫైల్‌పై క్లిక్ చేయండి, ఎక్సెల్‌ను ఎగుమతి చేయండి మరియు ఫలితాలను వీక్షించండి.ప్రతి బావి యొక్క విస్తరణ సామర్థ్యం మరియు R2 ఫలితాలు ప్రదర్శించబడతాయి.రెండవది, మీరు సమూహాలుగా విభజించినట్లయితే, సరిదిద్దబడిన సగటు యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం ప్రదర్శించబడుతుంది.ప్రతి ప్రైమర్ యొక్క యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం 85% మరియు 115% మధ్య ఉండేలా చూసుకోండి.ఇది చాలా పెద్దది లేదా చాలా చిన్నది అయితే, ప్రైమర్ యొక్క యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం తక్కువగా ఉందని అర్థం.

ఫిగ్ 8 ఫలితం మరియు డేటా అవుట్‌పుట్

ప్రయోగాత్మక ప్రక్రియ:
RNA నాణ్యత అవసరాలు:
స్వచ్ఛత:1.72.0 అవశేష ఐసోథియోసైనేట్ ఉండవచ్చని సూచిస్తుంది.క్లీన్ న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ A260/A230 2 చుట్టూ ఉండాలి.230 nm వద్ద బలమైన శోషణ ఉంటే, అది ఫెనేట్ అయాన్ల వంటి కర్బన సమ్మేళనాలు ఉన్నాయని సూచిస్తుంది.అదనంగా, దీనిని 1.5% అగరోజ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా గుర్తించవచ్చు.మార్కర్‌ను సూచించండి, ఎందుకంటే ssRNAకి డీనాటరేషన్ లేదు మరియు మాలిక్యులర్ వెయిట్ లాగరిథమ్‌కు సరళ సంబంధం లేదు మరియు పరమాణు బరువు సరిగ్గా వ్యక్తీకరించబడదు.ఏకాగ్రత: సిద్ధాంతపరంగాకాదు100ng/ul కంటే తక్కువ, ఏకాగ్రత చాలా తక్కువగా ఉంటే, స్వచ్ఛత సాధారణంగా తక్కువ పొడవుగా ఉండదు

Fig9 RNA జెల్

అదనంగా, నమూనా విలువైనది మరియు RNA గాఢత ఎక్కువగా ఉన్నట్లయితే, వెలికితీసిన తర్వాత దానిని ఆల్కట్ చేయాలని సిఫార్సు చేయబడింది మరియు రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కోసం 100-300ng/ul చివరి సాంద్రతకు RNAను పలుచన చేయండి.లోరివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ప్రక్రియ, mRNA లిప్యంతరీకరించబడినప్పుడు, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కోసం ప్రత్యేకంగా పాలీఏ టెయిల్‌లకు కట్టుబడి ఉండే ఒలిగో (dt) ప్రైమర్‌లు ఉపయోగించబడతాయి, అయితే lncRNA మరియు circRNA మొత్తం RNA యొక్క రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కోసం యాదృచ్ఛిక హెక్సామర్ (రాండమ్ 6 మెర్) ప్రైమర్‌లను ఉపయోగిస్తాయి.చాలా కంపెనీలు ఇప్పుడు ప్రత్యేక టైలింగ్ కిట్‌లను ప్రారంభించాయి.స్టెమ్-లూప్ పద్ధతికి, టైలింగ్ పద్ధతి మరింత అనుకూలమైనది, అధిక-నిర్గమాంశ మరియు రియాజెంట్-పొదుపు, కానీ ఒకే కుటుంబానికి చెందిన miRNAలను వేరుచేసే ప్రభావం స్టెమ్-లూప్ పద్ధతి వలె బాగా ఉండకూడదు.ప్రతి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కిట్‌కు జన్యు-నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌ల (స్టెమ్-లూప్స్) ఏకాగ్రత అవసరాలు ఉంటాయి.miRNA కోసం ఉపయోగించే అంతర్గత సూచన U6.స్టెమ్-లూప్ ఇన్‌వర్షన్ ప్రక్రియలో, U6 యొక్క ట్యూబ్‌ను విడిగా తిప్పాలి మరియు U6 యొక్క ముందు మరియు వెనుక ప్రైమర్‌లను నేరుగా జోడించాలి.CircRNA మరియు lncRNA రెండూ HKGలను అంతర్గత సూచనగా ఉపయోగించవచ్చు.లోcDNA గుర్తింపు,
RNAతో సమస్య లేకుంటే, cDNA కూడా బాగానే ఉండాలి.అయినప్పటికీ, ప్రయోగం యొక్క పరిపూర్ణతను అనుసరించినట్లయితే, cds నుండి gDNAని వేరు చేయగల అంతర్గత సూచన జన్యువు (రిఫరెన్స్ జీన్, RG)ని ఉపయోగించడం ఉత్తమం.సాధారణంగా, RG అనేది హౌస్ కీపింగ్ జన్యువు., HKG) చిత్రం 10లో చూపిన విధంగా;ఆ సమయంలో, నేను సోయాబీన్ నిల్వ ప్రోటీన్‌ను తయారు చేస్తున్నాను మరియు అంతర్గత సూచనగా ఇంట్రాన్‌లను కలిగి ఉన్న actin7ని ఉపయోగించాను.gDNAలో ఈ ప్రైమర్ యొక్క యాంప్లిఫైడ్ ఫ్రాగ్మెంట్ పరిమాణం 452bp, మరియు cDNAని టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించినట్లయితే, అది 142bp.అప్పుడు పరీక్ష ఫలితాలు cDNAలో కొంత భాగం వాస్తవానికి gDNA ద్వారా కలుషితమైందని మరియు రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ఫలితంతో ఎటువంటి సమస్య లేదని నిరూపించబడింది మరియు దీనిని PCR కోసం టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించవచ్చు.అగరోజ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్‌ను నేరుగా cDNAతో అమలు చేయడం పనికిరానిది మరియు ఇది ఒక డిఫ్యూజ్ బ్యాండ్, ఇది నమ్మదగినది కాదు.

Figure 10 cDNA గుర్తింపు

qPCR పరిస్థితుల నిర్ధారణకిట్ యొక్క ప్రోటోకాల్ ప్రకారం సాధారణంగా సమస్య లేదు, ప్రధానంగా tm విలువ యొక్క దశలో.ప్రైమర్ డిజైన్ సమయంలో కొన్ని ప్రైమర్‌లు సరిగ్గా రూపొందించబడనట్లయితే, tm విలువ మరియు థియరిటికల్ 60°C మధ్య పెద్ద వ్యత్యాసం ఏర్పడినట్లయితే, cDNA నమూనాలను కలిపిన తర్వాత, ప్రైమర్‌లతో గ్రేడియంట్ PCRని అమలు చేసి, బ్యాండ్‌లు లేకుండా ఉష్ణోగ్రతను TM విలువగా సెట్ చేయడాన్ని నివారించడానికి ప్రయత్నించండి.

డేటా విశ్లేషణ

సంప్రదాయ సంబంధిత ఫ్లోరోసెన్స్ క్వాంటిటేటివ్ PCR ప్రాసెసింగ్ పద్ధతి ప్రాథమికంగా 2 ప్రకారం ఉంటుంది-ΔΔCT.డేటా ప్రాసెసింగ్ టెంప్లేట్.

సంబంధిత ఉత్పత్తులు:

రియల్ టైమ్ PCR సులభం^TM -తక్మాన్

రియల్ టైమ్ PCR సులభం^TM -SYBR గ్రీన్ I

RT ఈజీ I (మొదటి స్ట్రాండ్ cDNA సంశ్లేషణ కోసం మాస్టర్ ప్రీమిక్స్)

RT ఈజీ II (qPCR కోసం మొదటి స్ట్రాండ్ cDNA సంశ్లేషణ కోసం మాస్టర్ ప్రీమిక్స్)