ప్రతి ఒక్కరూ qRT-PCR ప్రయోగం, ప్రైమర్ డిజైన్, ఫలితాల వివరణ మొదలైన సూత్రాల గురించి మాట్లాడుతున్నారు, అయితే నేను qRT-PCR యొక్క ప్రయోగాత్మక కార్యాచరణను మీతో పంచుకోవాలని అనుకుంటున్నాను.ఇది చిన్నది, కానీ ఇది ఫలితాల గురించి.

qRT-PCR చేసే ముందు, మన స్వంత RNA మరియు ఆపరేషన్ పద్ధతుల గురించి మనకు స్పష్టమైన అవగాహన ఉండాలి.అన్నింటికంటే, మా ప్రయత్నాలు కేవలం సాధన చేయడం కంటే ఫలితాలను పొందడం లక్ష్యంగా పెట్టుకున్నాయి.కాబట్టి qRT-PCR చేయడానికి ముందు, మేము ఈ క్రింది సమస్యలను గుర్తించాలి (వీటిలో కొన్ని SYBRకి మాత్రమే వర్తిస్తాయి).

1 మీ RNA క్షీణించలేదని మీరు ఖచ్చితంగా అనుకుంటున్నారా?

నానోడ్రాప్ 2000 RNA యొక్క ఏకాగ్రత మరియు స్వచ్ఛతను మాత్రమే గుర్తించగలదు, కానీ RNA యొక్క సమగ్రతను గుర్తించలేదు.

RNA (RNA Intesity Number) విలువ RNA యొక్క సమగ్రతను ప్రతిబింబిస్తుంది, ఇది ఎజిలెంట్ 2100 బయోఅనలైజర్ సిస్టమ్ ద్వారా కనుగొనబడింది.

అత్తి. వివిధ RNA నమూనాల కోసం RIN విలువల స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం (యూకారియోట్లు)

అయితే, ప్రయోగశాలలలో సాధారణంగా ఎజిలెంట్ 2100 బయోఅనలైజర్ ఉండదు.ఈ సందర్భంలో, మేము ఫార్మాల్డిహైడ్ జెల్ ద్వారా గుర్తించగలము, అయితే మొత్తం RNA యొక్క అవసరం ఎక్కువగా ఉంటుంది, కాబట్టి సాధారణ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్‌ను ఉపయోగించడం వేగవంతమైన పద్ధతి.ఇది న్యూక్లీజ్ లేని వాతావరణంలో ఉండటం అవసరం, కాబట్టి ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ట్యాంక్, సోల్ బాటిల్, జెల్ బ్రాకెట్ మరియు దువ్వెనను DEPC నీటితో కడగడం అవసరం.అగరోజ్ కూడా న్యూక్లీస్ రహితంగా ఉంటుంది (తాజాగా తెరిచినంత కాలం), మరియు లోడింగ్ బఫర్‌ను 1.2% జెల్‌తో వీలైనంత వరకు తాజాగా తెరవాలి.

చిత్రంలో నమూనా 9లో చూపిన విధంగా, జెల్ పూర్తిగా కరిగిపోవాలని గమనించండి, లేకుంటే అది అసమాన బ్యాండ్‌లకు కారణమవుతుంది.వోల్టేజ్ చాలా ఎక్కువగా ఉంటే లేదా ఎక్కువసేపు నడుస్తున్నట్లయితే వేడిని ఉత్పత్తి చేస్తుంది మరియు RNA క్షీణతకు కారణమవుతుంది, కాబట్టి వోల్టేజ్ మరియు సమయాన్ని సహేతుకంగా నియంత్రించాలి.అదనంగా, జెల్ రన్నింగ్ నమూనాలో DNA అవశేషాలు ఉందో లేదో మరింత నిర్ధారిస్తుంది మరియు పంపిణీ చేసే బావిలో పెద్ద సంఖ్యలో నిలుపుకున్న బ్యాండ్‌లు ఉన్నాయో లేదో గమనించవచ్చు.

మూర్తి.RNA యొక్క జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ గుర్తింపు

2 మీ cDNA ఏకాగ్రత గురించి మీరు ఖచ్చితంగా ఉన్నారా?

ప్రయోగశాలలో పెద్ద సోదరుల అనుభవం ఏమిటంటే, ప్రతి విలోమం ద్వారా పొందిన 20 ul సిస్టమ్ యొక్క cDNA నేరుగా 20X పలుచన చేయబడుతుంది, అయితే పోస్ట్-డాక్టోరల్ సోదరీమణులు 10X పలుచన చేయబడతారు.నేను సాధారణంగా పరిస్థితిపై ఆధారపడి ఉంటాను.ప్రతి వ్యక్తి పేర్కొన్న RNA నాణ్యత భిన్నంగా ఉన్నందున, రివర్సల్ స్థాయి కూడా భిన్నంగా ఉంటుంది మరియు రివర్సల్ టెక్నాలజీ స్థిరంగా ఉండకపోవచ్చు.

కాబట్టి నేను రివర్స్డ్ cDNAని పొందిన ప్రతిసారీ, నేను మొదట దానిని దాదాపు 3 సార్లు పలుచన చేస్తాను, ఆపై RT-PCR చేయడానికి హౌస్ కీపింగ్ జన్యువును ఉపయోగిస్తాను, నిర్దిష్ట ఏకాగ్రతను గుర్తించడానికి, సైకిళ్ల సంఖ్య సాధారణంగా 25 చక్రాలు, ఆపై తుది పలుచన కారకాన్ని నిర్ణయిస్తుంది.

3 మీరు ఖచ్చితంగా మీ ప్రైమర్‌లను సులభంగా ఉపయోగించగలరా?

ఇది qRT-PCR యొక్క ద్రవీభవన వక్రతను దాటగలదు, కానీ దీనికి ఇంకా డబ్బు ఖర్చవుతుంది.ఎక్కువ డబ్బు లేని ప్రయోగశాలల కోసం, వారు చాలా ప్రైమర్‌లను పొందినప్పుడు, వారు సాధారణ RT-PCRని ఉపయోగించి అది ఒకే బ్యాండ్‌గా ఉందో లేదో చూడవచ్చు మరియు ప్రైమర్‌ల ప్రత్యేకతను గుర్తించవచ్చు.ప్రయోగశాలలో డబ్బు తక్కువగా ఉండకపోతే, అన్ని ప్రైమర్‌ల విశిష్టతను ద్రవీభవన వక్రరేఖ ద్వారా ఒకసారి గుర్తించవచ్చు.

4 మీ ప్రయోగాత్మక పరిస్థితులు అనుకూలంగా ఉన్నాయని మీరు ఖచ్చితంగా అనుకుంటున్నారా?

SYBR బలమైన కాంతి నుండి రక్షించబడాలి, కాబట్టి SYBR రియాజెంట్‌ని జోడించేటప్పుడు ఓవర్‌హెడ్ లైట్‌ని ఆఫ్ చేయడానికి ప్రయత్నించండి మరియు దానిని పూర్తి చేయడానికి మసక కాంతిని మాత్రమే ఉపయోగించాలి.

SYBRని 4°C వద్ద నిల్వ చేయండి.ఉపయోగంలో ఉన్నప్పుడు, నురుగు రాకుండా బాగా కలపడానికి మెల్లగా పైకి క్రిందికి తిప్పండి మరియు తీవ్రంగా సుడిగుండం లేదు.

కొంతమంది చెల్లెళ్లు శాంపిల్స్‌ను మిక్స్ చేస్తారనే భయంతో PCR బోర్డులో మార్కులు వేయడానికి ఇష్టపడతారు, ఇది తప్పు.మీ మార్కర్‌లు ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్‌ల సేకరణను ప్రభావితం చేసే అవకాశం ఉన్నందున, దిగువ చూపిన విధంగా మెమరీలో సహాయం చేయడానికి ప్రయోగాత్మక నోట్‌బుక్‌లను ఉపయోగించమని నేను సాధారణంగా జూనియర్‌లను సిఫార్సు చేస్తున్నాను.

మూర్తి.qRT-PCR నమూనా లోడింగ్ రేఖాచిత్రం

5 మీరు సరిగ్గా చేస్తున్నారా?

చేతి తొడుగులు ధరించడం, చేతి తొడుగులు ధరించడం, చేతి తొడుగులు ధరించడం మరియు ముఖ్యమైన విషయాలు మూడుసార్లు చెప్పాలని నిర్ధారించుకోండి.

SYBR కాంతికి బహిర్గతం కావడాన్ని తగ్గించడానికి, నేను వ్యక్తిగతంగా దిగువ చిత్రంలో చూపిన విధంగా ముందుగా ఒక టెంప్లేట్‌ను జోడించాలనుకుంటున్నాను.అనుభవం ప్రకారం, తక్కువ మొత్తంలో టెంప్లేట్ జోడించడం వలన నమూనా లోపాలు ఏర్పడే అవకాశం ఉంది.అందువల్ల, తక్కువ మొత్తంలో టెంప్లేట్‌ని జోడించడం వల్ల ఏర్పడే లోపాన్ని తగ్గించడానికి, నేను సాధారణంగా నమూనాను మళ్లీ రెట్టింపు చేస్తాను మరియు జోడించిన H2O2 మొత్తాన్ని తగ్గించడానికి నమూనాను జోడించేటప్పుడు మొత్తాన్ని రెట్టింపు చేస్తాను.

మూర్తి.qRT-PCR లోడింగ్ యొక్క స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం

అప్పుడు qRT-PCR సిస్టమ్‌ను ఈ క్రింది విధంగా కాన్ఫిగర్ చేయండి.

మూర్తి.qRT-PCR సిస్టమ్ తయారీ రేఖాచిత్రం

గమనిక: కాన్ఫిగరేషన్ ప్రక్రియ మంచు మీద చేయాలి.

నమూనాను జోడించిన తర్వాత, పారదర్శక సీలింగ్ ఫిల్మ్‌ను అతికించండి.మీ చేతులతో పారదర్శక సీలింగ్ ఫిల్మ్ యొక్క ఉపరితలం తాకకుండా ప్రయత్నించండి, కేవలం చిత్రం యొక్క రెండు వైపులా ఖాళీ నుండి ఆపరేట్ చేయండి.ఎందుకంటే వేలిముద్రలు ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్స్ సేకరణను కూడా ప్రభావితం చేయవచ్చు.ఆపై నమూనా గోడపై వేలాడకుండా నిరోధించడానికి తక్కువ వేగంతో 10 సెకన్ల పాటు త్వరగా సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయడానికి సెంట్రిఫ్యూజ్‌ని ఉపయోగించండి.

సంబంధిత ఉత్పత్తులు:

సెల్ డైరెక్ట్ RT-qPCR కిట్

RT ఈజీ II