COVID-19 అనేది తీవ్రమైన అక్యూట్ రెస్పిరేటరీ సిండ్రోమ్ కరోనా వైరస్ టైప్ 2 వల్ల సంక్రమించే ఒక అంటు వ్యాధి. ఒక వ్యక్తి సోకినప్పుడు, జ్వరం, దగ్గు మరియు శ్వాసలోపం వంటి అత్యంత సాధారణ లక్షణాలు.

పరీక్ష కోసం ఉపయోగించే నమూనాలను నాసోఫారింజియల్ స్వాబ్స్ లేదా ఓరోఫారింజియల్ స్వాబ్స్ ద్వారా సేకరించవచ్చు.

PCR అంటే ఏమిటి?

కరోనావైరస్ గుర్తింపు యొక్క ప్రామాణిక పద్ధతి పాలిమరేస్ చైన్ రియాక్షన్, PCR.ఇది పరమాణు జీవశాస్త్రంలో విస్తృతంగా ఉపయోగించే పద్ధతి.ఇది మిలియన్ల నుండి బిలియన్ల నిర్దిష్ట DNA శకలాలను త్వరగా కాపీ చేయగలదు.

కొత్త కరోనావైరస్ చాలా పొడవైన సింగిల్ స్ట్రాండెడ్ RNA జన్యువును కలిగి ఉంది.PCR ద్వారా ఈ వైరస్‌లను గుర్తించేందుకు, RNA అణువులను రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ ద్వారా వాటి పరిపూరకరమైన DNA సీక్వెన్స్‌లుగా మార్చాలి, ఆపై కొత్తగా సంశ్లేషణ చేయబడిన DNA ప్రామాణిక PCR విధానాల ద్వారా విస్తరించబడుతుంది, దీనిని సాధారణంగా RT-PCR అని పిలుస్తారు.

RT-PCR ప్రక్రియ

RNA వెలికితీత

ఈ పద్ధతిని నిర్వహించడానికి, వైరల్ RNA ప్రాథమికంగా సంగ్రహించబడాలి.అనుకూలమైన, వేగవంతమైన మరియు ప్రభావవంతమైన విభజన కోసం వివిధ రకాల RNA శుద్ధి కిట్‌లను ఉపయోగించవచ్చు.

కమర్షియల్ కిట్‌ని ఉపయోగించి వైరల్ ఆర్‌ఎన్‌ఏను సేకరించేందుకు, ముందుగా నమూనాను మైక్రోసెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌కు జోడించి, ఆపై దానిని లైసిస్ బఫర్‌తో కలపండి.ఈ బఫర్ చాలా డీనాట్ చేయబడింది మరియు సాధారణంగా ఫినాల్ మరియు గ్వానిడిన్ ఐసోథియోసైనేట్‌లను కలిగి ఉంటుంది.అదనంగా, RNase ఇన్హిబిటర్లు సాధారణంగా లైసిస్ బఫర్‌లో చెక్కుచెదరకుండా ఉండే వైరల్ RNA యొక్క ఐసోలేషన్‌ను నిర్ధారించడానికి ఉంటాయి.

లైసిస్ బఫర్‌ని జోడించిన తర్వాత, మిక్సింగ్ ట్యూబ్‌ను పల్స్ ద్వారా వోర్టెక్స్ చేసి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద పొదిగించండి.వైరస్ అప్పుడు లైసిస్ బఫర్ అందించిన అత్యంత డీనాటరింగ్ పరిస్థితులలో లైస్ చేయబడుతుంది.

నమూనా లైస్ చేసిన తర్వాత, శుద్దీకరణ ప్రక్రియ కోసం సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్ ఉపయోగించబడుతుంది.నమూనా సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లోకి లోడ్ చేయబడుతుంది మరియు తర్వాత సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడుతుంది.

ఈ విధానం ఒక ఘన దశ వెలికితీత పద్ధతి, దీనిలో స్థిరమైన దశ సిలికా జెల్ మాతృకను కలిగి ఉంటుంది.

సరైన ఉప్పు మరియు pH పరిస్థితులలో, RNA అణువులు సిలికా పొరతో బంధిస్తాయి.

అదే సమయంలో, ప్రోటీన్ మరియు ఇతర కలుషితాలు తొలగించబడతాయి.

సెంట్రిఫ్యూగేషన్ తర్వాత, సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌ను శుభ్రమైన సేకరణ ట్యూబ్‌లో ఉంచండి, ఫిల్ట్‌రేట్‌ను విస్మరించండి, ఆపై వాషింగ్ బఫర్‌ను జోడించండి.

పొర ద్వారా వాష్ బఫర్‌ను బలవంతంగా చేయడానికి ట్యూబ్‌ను మళ్లీ సెంట్రిఫ్యూజ్‌లో ఉంచండి.ఇది పొర నుండి మిగిలిన అన్ని మలినాలను తొలగిస్తుంది, RNA మాత్రమే సిలికా జెల్‌కు కట్టుబడి ఉంటుంది.

నమూనా కడిగిన తర్వాత, ట్యూబ్‌ను శుభ్రమైన మైక్రోసెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లో ఉంచండి మరియు ఎలుషన్ బఫర్‌ను జోడించండి.

ఇది పొర ద్వారా ఎలుషన్ బఫర్‌ను బలవంతం చేయడానికి సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడింది.ఎలుషన్ బఫర్ స్పిన్ కాలమ్ నుండి వైరల్ RNA ను తొలగిస్తుంది మరియు ప్రోటీన్లు, ఇన్హిబిటర్లు మరియు ఇతర కలుషితాలు లేకుండా శుద్ధి చేయబడిన RNAను పొందుతుంది.

దశ 2

మిశ్రమ ఏకాగ్రత

వైరల్ RNAను సంగ్రహించిన తర్వాత, PCR విస్తరణ కోసం ప్రతిచర్య మిశ్రమాన్ని సిద్ధం చేయడం తదుపరి దశ.ఈ దశలో, ఏకాగ్రత ఉపయోగించబడుతుంది.ఈ సాంద్రీకృత పరిష్కారం ప్రీమిక్స్, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్, న్యూక్లియోటైడ్‌లు, ఫార్వర్డ్ ప్రైమర్, రివర్స్ ప్రైమర్, టాక్మాన్ ప్రోబ్ మరియు DNA పాలిమరేస్‌లతో కూడిన ప్రీమిక్స్డ్ సాంద్రీకృత పరిష్కారం.

చివరగా, ఈ ప్రతిచర్య మిశ్రమాన్ని పూర్తి చేయడానికి, RNA టెంప్లేట్ జోడించబడుతుంది.గొట్టాలు పల్స్ వోర్టెక్సింగ్ ద్వారా కలుపుతారు, ఆపై ప్రతిచర్య మిశ్రమం PCR ప్లేట్‌లోకి లోడ్ చేయబడుతుంది.PCR ప్లేట్ సాధారణంగా 96 బావులను కలిగి ఉంటుంది మరియు అదే సమయంలో బహుళ నమూనాలను విశ్లేషించగలదు.

దశ 3

PCR విస్తరణ

తరువాత, PCR మెషీన్‌లో ప్లేట్‌ను ఉంచండి, ఇది తప్పనిసరిగా థర్మల్ సైక్లర్.

RdrRP జన్యువు, E జన్యువు మరియు N జన్యువులలో లక్ష్య క్రమాన్ని విస్తరించడం ద్వారా 2019 నవల కరోనావైరస్‌ను గుర్తించడానికి రియల్-టైమ్ RT-PCR ఉపయోగించబడుతుంది.లక్ష్య జన్యువు ఎంపిక ప్రైమర్ మరియు ప్రోబ్ సీక్వెన్స్‌పై ఆధారపడి ఉంటుంది.

RT-PCR యొక్క మొదటి దశ రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్.కాంప్లిమెంటరీ DNA యొక్క మొదటి స్ట్రాండ్ సంశ్లేషణ చేయబడింది, ఇది PCR రివర్స్ ప్రైమర్ ద్వారా ప్రారంభించబడుతుంది, ఇది వైరల్ RNA జన్యువు యొక్క పరిపూరకరమైన భాగానికి బంధిస్తుంది.అప్పుడు రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ DNA న్యూక్లియోటైడ్‌లను ప్రైమర్ యొక్క 3′ఎండ్‌కు జోడించి వైరల్ RNAకు అనుబంధంగా DNAను సంశ్లేషణ చేస్తుంది.ఈ దశ యొక్క ఉష్ణోగ్రత మరియు వ్యవధి ఉపయోగించిన ప్రైమర్‌లు, టార్గెట్ RNA మరియు రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్‌పై ఆధారపడి ఉంటుంది.

తరువాత, ప్రారంభ డీనాటరేషన్ దశ వర్తించబడుతుంది, దీని ఫలితంగా RNA-DNA హైబ్రిడ్ డీనాటరేషన్ జరుగుతుంది.DNA పాలిమరేస్‌ను సక్రియం చేయడానికి ఈ దశ అవసరం.అదే సమయంలో, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ నిష్క్రియం చేయబడుతుంది.

PCR ఉష్ణ చక్రాల శ్రేణిని కలిగి ఉంటుంది.ప్రతి చక్రం డీనాటరేషన్, ఎనియలింగ్ మరియు పొడిగింపు దశలను కలిగి ఉంటుంది.

డీనాటరేషన్ స్టెప్‌లో రియాక్షన్ ఛాంబర్‌ను 95 డిగ్రీల సెల్సియస్‌కు వేడి చేయడం మరియు డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA టెంప్లేట్ యొక్క డీనాటరేషన్ కోసం దాన్ని ఉపయోగించడం ఉంటుంది.

తదుపరి దశలో, ప్రతిచర్య ఉష్ణోగ్రత 58 డిగ్రీల సెల్సియస్‌కు తగ్గించబడుతుంది, దీని వలన ఫార్వర్డ్ ప్రైమర్ దాని సింగిల్ స్ట్రాండెడ్ DNA టెంప్లేట్ యొక్క పరిపూరకరమైన భాగానికి ఎనియల్ చేయడానికి అనుమతిస్తుంది.ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత నేరుగా ప్రైమర్ యొక్క పొడవు మరియు కూర్పుపై ఆధారపడి ఉంటుంది.

పొడిగింపు దశలో, DNA పాలిమరేస్ DNA టెంప్లేట్ స్ట్రాండ్‌కు అనుబంధంగా ఉండే కొత్త DNA స్ట్రాండ్‌ను సంశ్లేషణ చేస్తుంది.ప్రతిచర్య మిశ్రమం నుండి 5′ నుండి 3′దిశలో టెంప్లేట్‌కు పరిపూరకరమైన ఉచిత న్యూక్లియైలను జోడించడం ద్వారా.ఈ దశ యొక్క ఉష్ణోగ్రత ఉపయోగించిన DNA పాలిమరేస్‌పై ఆధారపడి ఉంటుంది.

మొదటి చక్రం తర్వాత, డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA లక్ష్యం పొందబడుతుంది.

తరువాత, రెండవ చక్రంలో ప్రవేశించండి.రెండు సింగిల్ స్ట్రాండెడ్ DNA అణువులను ఉత్పత్తి చేయడానికి డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA డీనాట్ చేయబడింది.

తదుపరి దశలో, ప్రతిచర్య ఉష్ణోగ్రత తగ్గించబడుతుంది, ప్రైమర్‌లు ప్రతి సింగిల్ స్ట్రాండెడ్ DNA టెంప్లేట్‌కు అనీల్ చేయబడతాయి మరియు Taq-man ప్రోబ్ లక్ష్య DNA యొక్క పరిపూరకరమైన భాగానికి ఎనియల్ చేయబడుతుంది.

TaqMan ప్రోబ్‌లో ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్ ప్రోబ్ యొక్క 5′ ముగింపుతో సమయోజనీయంగా అనుసంధానించబడిన ఫ్లోరోఫోర్ ఉంటుంది.సైక్లర్ యొక్క కాంతి మూలం ద్వారా ఉత్తేజితం అయినప్పుడు, ఫ్లోరోఫోర్ ఫ్లోరోసెన్స్‌ను విడుదల చేస్తుంది.అదనంగా, ప్రోబ్ 3′ఎండ్ వద్ద క్వెన్చర్‌తో కూడి ఉంటుంది.క్వెన్చర్‌కు రిపోర్టర్ జన్యువు యొక్క సామీప్యత ఫ్లోరోసెన్స్‌ను గుర్తించడాన్ని నిరోధిస్తుంది.

పొడిగింపు దశలో, DNA పాలిమరేస్ కొత్త స్ట్రాండ్‌ను సంశ్లేషణ చేస్తుంది.పాలీమరేస్ TaqMan ప్రోబ్‌కి చేరుకున్నప్పుడు, దాని అంతర్జాత 5′న్యూక్లీస్ యాక్టివిటీ ప్రోబ్‌ను క్లివ్ చేస్తుంది, క్వెన్చర్ నుండి డైని వేరు చేస్తుంది.

PCR యొక్క ప్రతి చక్రంతో, ఎక్కువ రంగు అణువులు విడుదల చేయబడతాయి, ఫలితంగా సంశ్లేషణ చేయబడిన యాంప్లికాన్‌ల సంఖ్యకు అనులోమానుపాతంలో ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రత పెరుగుతుంది.

ఈ పద్ధతి నమూనాలో ఇవ్వబడిన సీక్వెన్స్ సంఖ్యను అంచనా వేయడానికి అనుమతిస్తుంది.ప్రతి చక్రంలో డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA శకలాల సంఖ్య రెట్టింపు అవుతుంది.కాబట్టి, PCR చాలా చిన్న నమూనాలను విశ్లేషించడానికి ఉపయోగించవచ్చు.

ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్‌ను కొలిచేందుకు, టంగ్‌స్టన్ హాలోజన్ ల్యాంప్, ఎక్సైటేషన్ ఫిల్టర్, రిఫ్లెక్టర్, లెన్స్, ఎమిషన్ ఫిల్టర్ మరియు ఛార్జ్ కపుల్డ్ డివైస్-యూజ్ CCD కెమెరా.

STEP 4 గుర్తించండి

ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్‌ను కొలిచేందుకు, టంగ్‌స్టన్ హాలోజన్ ల్యాంప్, ఎక్సైటేషన్ ఫిల్టర్, రిఫ్లెక్టర్, లెన్స్, ఎమిషన్ ఫిల్టర్ మరియు ఛార్జ్ కపుల్డ్ డివైస్-యూజ్ CCD కెమెరా.

దీపం నుండి ఫిల్టర్ చేయబడిన కాంతి రిఫ్లెక్టర్ ద్వారా ప్రతిబింబిస్తుంది, కండెన్సర్ లెన్స్ గుండా వెళుతుంది మరియు ప్రతి రంధ్రం మధ్యలో కేంద్రీకరించబడుతుంది.అప్పుడు రంధ్రం నుండి వెలువడే ఫ్లోరోసెన్స్ అద్దం నుండి ప్రతిబింబిస్తుంది, ఉద్గార వడపోత గుండా వెళుతుంది మరియు CCD కెమెరా ద్వారా గుర్తించబడుతుంది.ప్రతి PCR చక్రంలో, స్వీయ-ఉత్తేజిత ఫ్లోరోఫోర్ కాంతిని CCD ద్వారా గుర్తించవచ్చు.

ఇది సంగ్రహించిన కాంతిని డిజిటల్ డేటాగా మారుస్తుంది.ఈ పద్ధతిని నిజ-సమయ PCR అని పిలుస్తారు మరియు ఇది PCR ప్రతిచర్య యొక్క పురోగతిని నిజ-సమయ పర్యవేక్షణను అనుమతిస్తుంది.