PCR (పాలిమరేస్ చైన్ రియాక్షన్) అనేది ఇన్-విట్రో DNA యాంప్లిఫికేషన్ టెక్నాలజీలలో ఒకటి, 30 సంవత్సరాల కంటే ఎక్కువ చరిత్ర ఉంది.

PCR టెక్నాలజీని 1983లో Cetus, USAకి చెందిన కారీ ముల్లిస్ ప్రారంభించారు. ముల్లిస్ 1985లో PCR పేటెంట్ కోసం దరఖాస్తు చేసుకున్నారు మరియు అదే సంవత్సరంలో సైన్స్‌పై మొదటి PCR అకడమిక్ పేపర్‌ను ప్రచురించారు.ముల్లిస్‌కు 1993లో రసాయన శాస్త్రంలో నోబెల్ బహుమతి లభించింది.

PCR యొక్క ప్రాథమిక సూత్రాలు

PCR లక్ష్య DNA శకలాలను ఒక మిలియన్ కంటే ఎక్కువ సార్లు విస్తరించగలదు.ఈ సూత్రం DNA పాలిమరేస్ ఉత్ప్రేరకంలో ఉంది, పేరెంట్ స్ట్రాండ్ DNAని టెంప్లేట్‌గా మరియు నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌ని పొడిగింపు కోసం ప్రారంభ బిందువుగా ఉపయోగిస్తుంది.డీనాటరేషన్, ఎనియలింగ్ మరియు ఎక్స్‌టెన్షన్ వంటి దశల ద్వారా ఇది విట్రోలో ప్రతిరూపం పొందుతుంది.కుమార్తె స్ట్రాండ్ DNA యొక్క ప్రక్రియ మాతృ స్ట్రాండ్ టెంప్లేట్ DNAకి పరిపూరకరమైనది.

ప్రామాణిక PCR ప్రక్రియ మూడు దశలుగా విభజించబడింది:

1.Denaturation: DNA డబుల్ స్ట్రాండ్‌లను వేరు చేయడానికి అధిక ఉష్ణోగ్రతను ఉపయోగించండి.DNA డబుల్ స్ట్రాండ్‌ల మధ్య హైడ్రోజన్ బంధం అధిక ఉష్ణోగ్రత వద్ద (93-98℃) విచ్ఛిన్నమవుతుంది.

2.అనియలింగ్: డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA వేరు చేయబడిన తర్వాత, ఉష్ణోగ్రతను తగ్గించండి, తద్వారా ప్రైమర్ సింగిల్ స్ట్రాండెడ్ DNAకి కట్టుబడి ఉంటుంది.

3.ఎక్స్‌టెన్షన్: DNA పాలిమరేస్ ఉష్ణోగ్రత తగ్గించబడినప్పుడు కట్టుబడి ఉండే ప్రైమర్‌ల నుండి DNA తంతువుల వెంట పరిపూరకరమైన తంతువులను సంశ్లేషణ చేయడం ప్రారంభిస్తుంది.పొడిగింపు పూర్తయినప్పుడు, ఒక చక్రం పూర్తవుతుంది మరియు DNA శకలాల సంఖ్య రెట్టింపు అవుతుంది

ఈ మూడు దశలను 25-35 సార్లు పరస్పరం చేస్తే, DNA శకలాలు విపరీతంగా పెరుగుతాయి.

PCR యొక్క చాతుర్యం ఏమిటంటే, విభిన్న లక్ష్య జన్యువుల కోసం వేర్వేరు ప్రైమర్‌లను రూపొందించవచ్చు, తద్వారా లక్ష్య జన్యు శకలాలు తక్కువ వ్యవధిలో విస్తరించబడతాయి.

ఇప్పటివరకు, PCRని సాధారణ PCR, ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR మరియు డిజిటల్ PCR అని మూడు వర్గాలుగా విభజించవచ్చు.

సాధారణ PCR యొక్క మొదటి తరం

లక్ష్య జన్యువును విస్తరించడానికి ఒక సాధారణ PCR యాంప్లిఫికేషన్ పరికరాన్ని ఉపయోగించండి, ఆపై ఉత్పత్తిని గుర్తించడానికి అగ్రోస్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్‌ను ఉపయోగించండి, గుణాత్మక విశ్లేషణ మాత్రమే చేయబడుతుంది.

మొదటి తరం PCR యొక్క ప్రధాన ప్రతికూలతలు:

1.నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ మరియు తప్పుడు సానుకూల ఫలితాలకు అవకాశం ఉంది.

2. గుర్తింపు చాలా సమయం పడుతుంది మరియు ఆపరేషన్ గజిబిజిగా ఉంటుంది.

3. గుణాత్మక పరీక్ష మాత్రమే చేయవచ్చు

రెండవ తరం రియల్-టైమ్ PCR

నిజ-సమయ PCR, qPCR అని కూడా పిలుస్తారు, ఇది ప్రతిచర్య వ్యవస్థ యొక్క పురోగతిని సూచించగల ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్‌లను ఉపయోగిస్తుంది మరియు ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్‌ల సంచితం ద్వారా విస్తరించిన ఉత్పత్తుల సంచితాన్ని పర్యవేక్షిస్తుంది మరియు ఫ్లోరోసెన్స్ కర్వ్ ద్వారా ఫలితాలను నిర్ధారిస్తుంది.ఇది Cq విలువ మరియు ప్రామాణిక వక్రరేఖ సహాయంతో లెక్కించబడుతుంది.

qPCR సాంకేతికత క్లోజ్డ్ సిస్టమ్‌లో నిర్వహించబడుతున్నందున, కాలుష్యం యొక్క సంభావ్యత తగ్గుతుంది మరియు పరిమాణాత్మక గుర్తింపు కోసం ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్‌ను పర్యవేక్షించవచ్చు, కాబట్టి ఇది క్లినికల్ ప్రాక్టీస్‌లో అత్యంత విస్తృతంగా ఉపయోగించబడుతుంది మరియు PCRలో ఆధిపత్య సాంకేతికతగా మారింది.

నిజ-సమయ ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCRలో ఉపయోగించే ఫ్లోరోసెంట్ పదార్థాలను ఇలా విభజించవచ్చు: TaqMan ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్, మాలిక్యులర్ బీకాన్‌లు మరియు ఫ్లోరోసెంట్ డై.

1) TaqMan ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్:

PCR యాంప్లిఫికేషన్ సమయంలో, ఒక జత ప్రైమర్‌ను జోడించేటప్పుడు నిర్దిష్ట ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్ జోడించబడుతుంది.ప్రోబ్ ఒక ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్, మరియు రెండు చివరలు రిపోర్టర్ ఫ్లోరోసెంట్ గ్రూప్ మరియు క్వెన్చర్ ఫ్లోరోసెంట్ గ్రూప్‌తో లేబుల్ చేయబడ్డాయి.

ప్రోబ్ చెక్కుచెదరకుండా ఉన్నప్పుడు, రిపోర్టర్ గ్రూప్ ద్వారా విడుదలయ్యే ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్ క్వెన్చింగ్ గ్రూప్ ద్వారా గ్రహించబడుతుంది;PCR యాంప్లిఫికేషన్ సమయంలో, టాక్ ఎంజైమ్ యొక్క 5′-3′ ఎక్సోన్యూకలీస్ చర్య ప్రోబ్‌ను క్లీవ్ చేస్తుంది మరియు క్షీణిస్తుంది, రిపోర్టర్ ఫ్లోరోసెంట్ గ్రూప్ మరియు క్వెన్చర్‌గా చేస్తుంది, ఫ్లోరోసెంట్ గ్రూప్ వేరు చేయబడుతుంది, తద్వారా ఫ్లోరోసెన్స్ మానిటరింగ్ సిస్టమ్ ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్‌ను అందుకోగలదు, అనగా, ప్రతిసారీ డీఎన్‌ఏ ఒక ఫ్లోరోసెన్స్ సంకేతాన్ని పొందుతుంది. ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్ యొక్క లేషన్ PCR ఉత్పత్తి ఏర్పడటంతో పూర్తిగా సమకాలీకరించబడుతుంది.

2) SYBR ఫ్లోరోసెంట్ డై:

PCR ప్రతిచర్య వ్యవస్థలో, SYBR ఫ్లోరోసెంట్ డై అధికంగా జోడించబడుతుంది.SYBR ఫ్లోరోసెంట్ డైని నిర్దిష్టంగా DNA డబుల్ స్ట్రాండ్‌లో చేర్చని తర్వాత, అది ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్‌ను విడుదల చేస్తుంది.గొలుసులో చేర్చబడని SYBR డై మాలిక్యూల్ ఎటువంటి ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్‌ను విడుదల చేయదు, తద్వారా ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్‌ను నిర్ధారిస్తుంది PCR ఉత్పత్తుల పెరుగుదల PCR ఉత్పత్తుల పెరుగుదలతో పూర్తిగా సమకాలీకరించబడుతుంది.SYBR డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNAతో మాత్రమే బంధిస్తుంది, కాబట్టి PCR ప్రతిచర్య నిర్దిష్టంగా ఉందో లేదో తెలుసుకోవడానికి ద్రవీభవన వక్రరేఖను ఉపయోగించవచ్చు.

3) మాలిక్యులర్ బెకన్:

ఇది ఒక స్టెమ్-లూప్ డబుల్-లేబుల్ ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్ ప్రోబ్, ఇది 5 మరియు 3 చివర్లలో సుమారు 8 బేస్‌ల హెయిర్‌పిన్ నిర్మాణాన్ని ఏర్పరుస్తుంది.రెండు చివర్లలోని న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ సీక్వెన్సులు పరిపూరకంగా జతచేయబడతాయి, దీని వలన ఫ్లోరోసెంట్ సమూహం మరియు క్వెన్చింగ్ గ్రూప్ బిగుతుగా ఉంటాయి.దగ్గరగా, ఫ్లోరోసెన్స్ ఉత్పత్తి చేయబడదు.

PCR ఉత్పత్తి ఉత్పత్తి చేయబడిన తర్వాత, ఎనియలింగ్ ప్రక్రియలో, పరమాణు బెకన్ యొక్క మధ్య భాగం ఒక నిర్దిష్ట DNA క్రమంతో జత చేయబడుతుంది మరియు ఫ్లోరోసెన్స్‌ను ఉత్పత్తి చేయడానికి ఫ్లోరోసెంట్ జన్యువు క్వెన్చర్ జన్యువు నుండి వేరు చేయబడుతుంది.

రెండవ తరం PCR యొక్క ప్రధాన ప్రతికూలతలు:

సున్నితత్వం ఇప్పటికీ లేదు మరియు తక్కువ-కాపీ నమూనాలను గుర్తించడం సరికాదు.

నేపథ్య విలువ యొక్క ప్రభావం ఉంది మరియు ఫలితంగా జోక్యానికి అవకాశం ఉంది.

ప్రతిచర్య వ్యవస్థలో PCR ఇన్హిబిటర్లు ఉన్నప్పుడు, గుర్తింపు ఫలితాలు జోక్యానికి గురవుతాయి.

మూడవ తరం డిజిటల్ PCR

డిజిటల్ PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) లక్ష్య శ్రేణి యొక్క కాపీ సంఖ్యను ముగింపు-పాయింట్ గుర్తింపు ద్వారా గణిస్తుంది మరియు అంతర్గత నియంత్రణలు మరియు ప్రామాణిక వక్రతలను ఉపయోగించకుండా ఖచ్చితమైన సంపూర్ణ పరిమాణాత్మక గుర్తింపును నిర్వహించగలదు.

డిజిటల్ PCR ముగింపు-పాయింట్ గుర్తింపును ఉపయోగిస్తుంది మరియు Ct విలువ (సైకిల్ థ్రెషోల్డ్)పై ఆధారపడదు, కాబట్టి డిజిటల్ PCR ప్రతిచర్య యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం ద్వారా తక్కువగా ప్రభావితమవుతుంది మరియు PCR ప్రతిచర్య నిరోధకాలకు సహనం అధిక ఖచ్చితత్వం మరియు పునరుత్పత్తితో మెరుగుపడుతుంది.

అధిక సున్నితత్వం మరియు అధిక ఖచ్చితత్వం యొక్క లక్షణాల కారణంగా, ఇది PCR ప్రతిచర్య నిరోధకాలచే సులభంగా జోక్యం చేసుకోదు మరియు ఇది పరిశోధన మరియు అప్లికేషన్ హాట్‌స్పాట్‌గా మారిన ప్రామాణిక ఉత్పత్తులు లేకుండా నిజమైన సంపూర్ణ పరిమాణాన్ని సాధించగలదు.

ప్రతిచర్య యూనిట్ యొక్క వివిధ రూపాల ప్రకారం, దీనిని మూడు ప్రధాన రకాలుగా విభజించవచ్చు: మైక్రోఫ్లూయిడ్, చిప్ మరియు బిందు వ్యవస్థలు.

1) మైక్రోఫ్లూయిడ్ డిజిటల్ PCR, mdPCR:

మైక్రోఫ్లూయిడ్ టెక్నాలజీ ఆధారంగా, DNA టెంప్లేట్ వేరు చేయబడింది.మైక్రోఫ్లూయిడ్ సాంకేతికత నమూనా నానో-అప్‌గ్రేడ్ లేదా చిన్న బిందువుల ఉత్పత్తిని గ్రహించగలదు, అయితే తుంపరలకు ప్రత్యేక శోషణ పద్ధతి అవసరం మరియు తరువాత PCR ప్రతిచర్య వ్యవస్థతో కలపబడుతుంది.mdPCR క్రమంగా ఇతర పద్ధతుల ద్వారా భర్తీ చేయబడింది.

2) చుక్కల ఆధారిత డిజిటల్ PCR, ddPCR:

నమూనాను బిందువులుగా ప్రాసెస్ చేయడానికి వాటర్-ఇన్-ఆయిల్ డ్రాప్లెట్ జనరేషన్ టెక్నాలజీని ఉపయోగించండి మరియు న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ అణువులను కలిగి ఉన్న ప్రతిచర్య వ్యవస్థను వేలకొద్దీ నానోస్కేల్ బిందువులుగా విభజించండి, వీటిలో ప్రతి ఒక్కటి న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ లక్ష్య అణువును కలిగి ఉండదు లేదా పరీక్షించాల్సిన ఒకటి నుండి అనేక న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ లక్ష్య అణువులను కలిగి ఉంటుంది.

3) చిప్ ఆధారిత డిజిటల్ PCR, cdPCR:

సిలికాన్ పొరలు లేదా క్వార్ట్జ్ గ్లాస్‌పై అనేక మైక్రోట్యూబ్‌లు మరియు మైక్రోకావిటీలను చెక్కడానికి ఇంటిగ్రేటెడ్ ఫ్లూయిడ్ పాత్‌వే టెక్నాలజీని ఉపయోగించండి మరియు వివిధ నియంత్రణ కవాటాల ద్వారా ద్రావణం యొక్క ప్రవాహాన్ని నియంత్రించండి మరియు సంపూర్ణ పరిమాణాన్ని సాధించడానికి డిజిటల్ PCR ప్రతిచర్య కోసం నమూనా ద్రవాన్ని అదే పరిమాణంలోని నానోమీటర్‌లుగా రియాక్షన్ బావులుగా విభజించండి.

మూడవ తరం PCR యొక్క ప్రధాన ప్రతికూలతలు:

పరికరాలు మరియు కారకాలు ఖరీదైనవి.

టెంప్లేట్ నాణ్యత అవసరాలు ఎక్కువగా ఉన్నాయి.టెంప్లేట్ పరిమాణం మైక్రోసిస్టమ్ పరిమాణాన్ని మించి ఉంటే, అది లెక్కించడం అసాధ్యం, మరియు అది చాలా తక్కువగా ఉంటే, పరిమాణ ఖచ్చితత్వం తగ్గించబడుతుంది.

నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ ఉన్నప్పుడు ఫాల్స్ పాజిటివ్‌లు కూడా ఉత్పన్నమవుతాయి.