PCR, బహుళ PCR, సిటు PCR, రివర్స్ PCR, RT-PCR, qPCR (1)–PCR

మేము వివిధ PCR యొక్క భావనలు, దశలు మరియు వివరాలను క్రమబద్ధీకరిస్తాము

Ⅰ. PCR

పాలిమరేస్ చైన్ రియాక్షన్, PCRగా సూచించబడుతుంది, ఇది నిర్దిష్ట DNA శకలాలు విస్తరించడానికి ఉపయోగించే పరమాణు జీవ సాంకేతికత.ఇది విట్రోలో ప్రత్యేక DNA ప్రతిరూపణగా పరిగణించబడుతుంది.DNA పాలిమరేస్ (DNA పాలిమరేస్ I) 1955లోనే కనుగొనబడింది మరియు ప్రయోగాత్మక విలువ మరియు ప్రాక్టికాలిటీ కలిగిన E. Coli యొక్క క్లెనో ఫ్రాగ్‌మెంట్‌ను 1970ల ప్రారంభంలో Dr. H. Klenow కనుగొన్నారు, అయితే ఈ ఎంజైమ్ ఉష్ణోగ్రతను తట్టుకోలేనందున, అధిక ఉష్ణోగ్రత దానిని క్షీణింపజేస్తుంది, కాబట్టి ఇది అధిక ఉష్ణోగ్రతతో క్షీణించదు.నేడు వాడుకలో ఉన్న ఎంజైమ్‌లు (టాక్ పాలిమరేస్ అని పిలుస్తారు), 1976లో హాట్ స్ప్రింగ్ బాక్టీరియం అయిన థర్మస్ ఆక్వాటికస్ నుండి వేరుచేయబడ్డాయి. దీని లక్షణం అధిక ఉష్ణోగ్రతను తట్టుకోగలదు మరియు ఆదర్శవంతమైన ఎంజైమ్, అయితే ఇది 1980ల తర్వాత విస్తృతంగా ఉపయోగించబడింది.PCR యొక్క అసలైన ఆదిమ నమూనా యొక్క అసలు భావన జన్యు మరమ్మత్తు మరియు కాపీ చేయడం వంటిది, దీనిని 1971లో డాక్టర్. KJell Kleppe ప్రతిపాదించారు. అతను మొదటి సాధారణ మరియు స్వల్పకాలిక జన్యు కాపీని ప్రచురించాడు (PCR యొక్క మొదటి రెండు చక్రాల ప్రతిచర్యల వలె).ఈరోజు అభివృద్ధి చేయబడిన PCRని 1983లో డాక్టర్ కారీ బి. ముల్లిస్ అభివృద్ధి చేశారు. డాక్టర్ ముల్లిస్ ఆ సంవత్సరం PE కంపెనీలకు సేవలందించారు, కాబట్టి PEకి PCR పరిశ్రమలో ప్రత్యేక హోదా ఉంది.డా. ముల్లిస్ 1985లో సైకి మరియు ఇతరులతో మొదటి సంబంధిత పత్రాన్ని అధికారికంగా ప్రచురించారు. అప్పటి నుండి, PCR యొక్క ఉపయోగం రోజుకు వేల మైళ్ల దూరంలో ఉంది మరియు సంబంధిత పత్రాల నాణ్యత అనేక ఇతర పరిశోధనా పద్ధతులను అసహ్యకరమైనదిగా చెప్పవచ్చు.తదనంతరం, PCR సాంకేతికత జీవశాస్త్ర పరిశోధన మరియు క్లినికల్ అప్లికేషన్లలో విస్తృతంగా ఉపయోగించబడుతుంది, ఇది పరమాణు జీవశాస్త్ర పరిశోధన యొక్క అత్యంత ముఖ్యమైన సాంకేతికతగా మారింది.ముల్లిస్ 1993లో రసాయన శాస్త్రంలో నోబెల్ బహుమతిని కూడా గెలుచుకున్నాడు.

PCRసూత్రం

PCR సాంకేతికత యొక్క ప్రాథమిక సూత్రం DNA యొక్క సహజ ప్రతిరూపణ ప్రక్రియను పోలి ఉంటుంది మరియు దాని విశిష్టత లక్ష్య శ్రేణి యొక్క రెండు చివరలకు అనుబంధంగా ఉండే ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్ ప్రైమర్‌పై ఆధారపడి ఉంటుంది.PCR క్షీణత-ఎనియలింగ్-విస్తరించే మూడు ప్రాథమిక ప్రతిచర్యల దశలతో కూడి ఉంటుంది: ① టెంప్లేట్ DNA యొక్క క్షీణత: టెంప్లేట్ DNA నిర్ణీత వ్యవధిలో సుమారు 93 ° C వరకు వేడి చేయబడిన తర్వాత, PCR యొక్క ద్వంద్వ-గొలుసు DNA కోసం ద్వంద్వ DNA పరిష్కారం ఏర్పడుతుంది.②టెంప్లేట్ DNA మరియు ప్రైమర్ యొక్క ఎనియలింగ్ (సమ్మేళనం): టెంప్లేట్ DNA వేడి చేయబడి, ఒకే చైన్‌గా క్షీణించిన తర్వాత, ఉష్ణోగ్రత దాదాపు 55°Cకి పడిపోతుంది.ప్రైమర్ మరియు టెంప్లేట్ DNA సింగిల్-చైన్ యొక్క కాంప్లిమెంటరీ సీక్వెన్స్.③ ప్రైమర్ యొక్క పొడిగింపు: DNA టెంప్లేట్-ప్రైమర్ బైండింగ్ TaqDNA పాలిమరేస్ చర్యపై ఆధారపడి ఉంటుంది, dNTP ప్రతిచర్య ముడి పదార్థంగా ఉంటుంది.ప్రతిరూపణ సూత్రాన్ని కొనసాగించండి, టెంప్లేట్ DNA గొలుసును పూర్తి చేసే కొత్త సెమీ-రిజర్వ్ చేయబడిన కాపీ చైన్‌ను సంశ్లేషణ చేయండి మరియు పునరావృత సైకిల్ డీజెనరేషన్-ఎనియలింగ్-ఎక్స్‌టెన్షన్ మూడు ప్రక్రియలు మరింత "సెమీ-రిజర్వ్డ్ కాపీ చైన్"ని పొందవచ్చు మరియు ఈ కొత్త చైన్ మళ్లీ అందుబాటులో ఉంది తదుపరి చక్రం కోసం టెంప్లేట్ అవ్వండి.లూప్‌ను పూర్తి చేయడానికి 2-4 నిమిషాలు పడుతుంది, లక్ష్య జన్యువును 2-3 గంటల్లో అనేక మిలియన్ సార్లు విస్తరించవచ్చు.

ప్రామాణికంPCRప్రతిచర్య వ్యవస్థ

PCR ప్రతిచర్య యొక్క ఐదు అంశాలు

PCR ప్రతిచర్యలో ప్రధానంగా ఐదు రకాల పదార్థాలు ఉన్నాయి, అవి ప్రైమర్, ఎంజైమ్, dNTP, టెంప్లేట్ మరియు బఫర్ (Mg2+ అవసరం).[PCR విధానం]

ప్రామాణిక PCR ప్రక్రియ మూడు దశలుగా విభజించబడింది

1. DNA క్షీణత (90°C-96°C): థర్మల్ చర్యలో ద్వంద్వ-గొలుసు DNA టెంప్లేట్‌లు, హైడ్రోజన్ బంధాలు విచ్ఛిన్నమై, ఒకే-గొలుసు DNAను ఏర్పరుస్తాయి.

2. ఎనియలింగ్ (25℃ -65℃): సిస్టమ్ ఉష్ణోగ్రత తగ్గించబడింది, ప్రైమర్ DNA టెంప్లేట్‌తో కలిపి స్థానిక ద్వంద్వ-గొలుసును ఏర్పరుస్తుంది.

3. పొడిగింపు (70℃ -75℃): టాక్ ఎంజైమ్ చర్యలో (సుమారు 72°C, ఉత్తమ కార్యాచరణ), dNTP ముడి పదార్థంగా ఉపయోగించబడుతుంది, ప్రైమర్ → 3′ ముగింపు యొక్క 5′ ముగింపు నుండి విస్తరించి, సంశ్లేషణ మరియు టెంప్లేట్ ఒకదానికొకటి DNA గొలుసును పూర్తి చేస్తాయి.

ప్రతి చక్రం డీనాట్ చేయబడి, ఎనియల్ చేయబడి మరియు పొడిగించబడి, DNA కంటెంట్‌ను రెట్టింపు చేస్తుంది.ప్రస్తుతం, తక్కువ యాంప్లిఫికేషన్ ప్రాంతం కారణంగా, Taq ఎంజైమ్ కార్యాచరణ సరైనది కానప్పటికీ, కొంత PCR చాలా తక్కువ సమయంలో పునరావృతమవుతుంది, కాబట్టి దీనిని రెండు దశలుగా మార్చవచ్చు, అంటే, ఎనియలింగ్ మరియు పొడిగింపును 60 ° C-65 ° C వద్ద ఒకేసారి చేయవచ్చు.ట్రైనింగ్ మరియు శీతలీకరణ ప్రక్రియను తగ్గించడానికి మరియు ప్రతిస్పందన వేగాన్ని మెరుగుపరచడానికి.

PCR ప్రతిచర్య లక్షణాలు

● అధిక-నిర్దిష్టత

PCR ప్రతిస్పందన యొక్క నిర్దిష్ట నిర్ణయాత్మక కారకాలు: ① ప్రైమర్ మరియు టెంప్లేట్ DNA యొక్క నిర్దిష్ట కలయిక.②బేస్ జత చేసే సూత్రం.③TaqDNA పాలిమరేస్ సంశ్లేషణ ప్రతిచర్య యొక్క లాయల్టీ.④ లక్ష్య జన్యువు యొక్క విశిష్టత మరియు సాంప్రదాయికత.

ప్రైమర్‌లు మరియు టెంప్లేట్‌ల సరైన కలయిక కీలకం.ప్రైమర్ మరియు టెంప్లేట్ యొక్క బైండింగ్ మరియు ప్రైమర్ చైన్ యొక్క పొడిగింపు ఆల్కలీన్ బేస్ మ్యాచింగ్ సూత్రంపై ఆధారపడి ఉంటాయి.పాలీమరేస్ సంశ్లేషణ ప్రతిచర్యల విధేయత మరియు చర్యలో టెంప్లేట్ మరియు ప్రైమర్ యొక్క బైండింగ్ (సమ్మేళనం) చేయడానికి Taq DNA పాలిమరేస్ యొక్క అధిక ఉష్ణోగ్రత నిరోధకతను అధిక ఉష్ణోగ్రత వద్ద నిర్వహించవచ్చు.కలయిక యొక్క ప్రత్యేకత బాగా పెరిగింది.క్లిప్ అధిక స్థాయి ఖచ్చితత్వాన్ని నిర్వహించగలదు.అధిక సాంప్రదాయికత మరియు అధిక సాంప్రదాయికతతో లక్ష్య జన్యు ప్రాంతాన్ని ఎంచుకోవడం ద్వారా, దాని విశిష్టత ఎక్కువగా ఉంటుంది.

● అధిక సున్నితత్వం

PCR ఉత్పత్తుల ఉత్పత్తి పరిమాణం సూచిక ద్వారా పెంచబడుతుంది, ఇది మైక్రోకంట్రోలర్ స్థాయిని మైక్రోగ్రాముల స్థాయికి (μg= -6) పెంచడానికి పికర్ (PG=10-12) యొక్క ప్రారంభ టెంప్లేట్‌ను విస్తరించవచ్చు.1 మిలియన్ కణాల నుండి లక్ష్య కణాలను గుర్తించవచ్చు;వైరస్ల గుర్తింపులో, PCR యొక్క సున్నితత్వం 3 RFUలకు చేరుకుంటుంది (ఖాళీ మచ్చలు ఏర్పడిన యూనిట్లు);బ్యాక్టీరియా శాస్త్రంలో కనీస గుర్తింపు రేటు 3 బ్యాక్టీరియా.

● సింపుల్ మరియు ఫాస్ట్

PCR ప్రతిబింబం అధిక-ఉష్ణోగ్రత Taq DNA పాలిమరేస్‌ను ఉపయోగిస్తుంది, ఇది ఒక సమయంలో ప్రతిచర్య పరిష్కారాన్ని జోడిస్తుంది, అంటే DNA యాంప్లిఫికేషన్ సొల్యూషన్ మరియు వాటర్ బాత్ పాట్‌పై క్షీణత-అనియల్-ఎక్స్‌టెన్షన్ రియాక్షన్.సాధారణంగా, యాంప్లిఫికేషన్ రియాక్షన్ 2 నుండి 4 గంటల్లో పూర్తవుతుంది.ఆగ్మెంటెడ్ ఉత్పత్తులు సాధారణంగా ఎలక్ట్రికల్ ఖడ్గం ద్వారా విశ్లేషించబడతాయి మరియు ఐసోటోప్‌లను ఉపయోగించాల్సిన అవసరం లేదు, రేడియోధార్మిక కాలుష్యం లేదు మరియు సులభమైన ప్రచారం.

● నమూనా యొక్క స్వచ్ఛత తక్కువగా ఉంది

వైరస్లు లేదా బ్యాక్టీరియా మరియు సంస్కృతి కణాలను వేరు చేయవలసిన అవసరం లేదు.DNA ముడి ఉత్పత్తులు మరియు RNA లను యాంప్లిఫైయర్‌లుగా ఉపయోగించవచ్చు.DNA యాంప్లిఫికేషన్ గుర్తింపును రక్తం, శరీర ద్రవం, దగ్గు వాషింగ్ ద్రవం, జుట్టు, కణాలు మరియు జీవ కణజాలం వంటి క్లినికల్ నమూనాలను ఉపయోగించి నేరుగా ఉపయోగించవచ్చు.

PCRసాధారణ సమస్యలు

● తప్పుడు ప్రతికూలం, విస్తరించిన బ్యాండ్‌లు లేవు

PCR ప్రతిచర్య యొక్క ముఖ్య దశలు: ① టెంప్లేట్ న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల తయారీ, ② నాణ్యత మరియు ప్రైమర్‌ల ప్రత్యేకత, ③ ఎంజైమ్‌ల నాణ్యత ④ PCR చక్రం పరిస్థితులు.కారణాన్ని కనుగొనడం కూడా పై లింక్‌ల కోసం విశ్లేషించి, అధ్యయనం చేయాలి.

టెంప్లేట్‌లు: ① టెంప్లేట్ వివిధ ప్రోటీన్‌లను కలిగి ఉంది, ② టెంప్లేట్‌లో టాక్ ఎంజైమ్ ఇన్హిబిటర్ ఉంది, ③ టెంప్లేట్‌లోని ప్రోటీన్ తొలగించబడలేదు, ముఖ్యంగా క్రోమోజోమ్‌లోని గ్రూప్ ప్రోటీన్.⑤ డెమినర్ న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ క్షీణత క్షుణ్ణంగా లేదు.ఎంజైమ్‌లు మరియు ప్రైమర్‌ల నాణ్యత బాగున్నప్పుడు, యాంప్లిఫికేషన్ బ్యాండ్ ఉండదు, ఇది చాలా మటుకు నమూనాల జీర్ణ చికిత్స.టెంప్లేట్ న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ వెలికితీత ప్రక్రియలో ఏదో తప్పు ఉంది, కాబట్టి సమర్థవంతమైన మరియు స్థిరమైన జీర్ణక్రియ పరిష్కారాన్ని సిద్ధం చేయడానికి, దాని విధానాన్ని పరిష్కరించాలి మరియు ఏకపక్షంగా మార్చకూడదు.

ఎంజైమ్ ఇనాక్టివేషన్: ఎంజైమ్ యాక్టివేషన్ కోల్పోయిందా లేదా సరిపోలేదా అని విశ్లేషించడానికి కొత్త ఎంజైమ్ లేదా పాత మరియు కొత్త ఎంజైమ్‌లను కలిపి ఉపయోగించాలి, ఇది తప్పుడు ప్రతికూలతలకు దారి తీస్తుంది.టాక్ ఎంజైమ్ లేదా ఎథిడియం బ్రోమైడ్ కొన్నిసార్లు మరచిపోతుందని గమనించాలి.

ప్రైమర్: ప్రైమర్ యొక్క నాణ్యత, ప్రైమర్ యొక్క ఏకాగ్రత మరియు రెండు ప్రైమర్‌ల ఏకాగ్రత సుష్టంగా ఉందా.PCR వైఫల్యానికి ఇది ఒక సాధారణ కారణం లేదా పెరుగుతున్న బ్యాండ్ అనువైనది కాదు మరియు వ్యాపించే అవకాశం లేదు.కొన్ని బ్యాచ్ నంబర్‌ల ప్రైమర్‌ల నాణ్యతతో సమస్యలు ఉన్నాయి.రెండు ప్రైమర్‌లు అధిక సాంద్రత మరియు తక్కువ గాఢతను కలిగి ఉంటాయి, దీని వలన తక్కువ సామర్థ్యం గల అసమాన విస్తరణ జరుగుతుంది.ప్రతిఘటనలు: ① యూనిట్‌లను సింథసైజ్ చేయడానికి మంచి ప్రైమర్‌ను ఎంచుకోండి.② ప్రైమర్ యొక్క ఏకాగ్రత OD విలువపై మాత్రమే ఆధారపడి ఉంటుంది, కానీ అగర్ షుగర్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ చేయడానికి ప్రైమర్ యొక్క అసలు ద్రవంపై కూడా శ్రద్ధ చూపుతుంది.తప్పనిసరిగా ప్రైమర్ స్ట్రిప్ జోన్ ఉండాలి మరియు రెండు ప్రైమర్‌ల ప్రకాశం సాధారణంగా స్థిరంగా ఉండాలి.బెల్ట్, PCR ఈ సమయంలో విఫలం కావచ్చు మరియు ఇది ప్రైమర్ సింథసిస్ యూనిట్‌తో పరిష్కరించబడాలి.ప్రైమర్ ఎక్కువగా ఉంటే, ప్రకాశం తక్కువగా ఉంటుంది మరియు పలుచన చేసినప్పుడు దాని ఏకాగ్రత సమతుల్యంగా ఉండాలి.③ రిఫ్రిజిరేటర్ యొక్క బహుళ గడ్డకట్టే లేదా దీర్ఘకాలిక శీతలీకరణ భాగాలను నిరోధించడానికి ప్రైమర్ చెల్లించబడాలి మరియు అధిక సాంద్రతలో నిల్వ చేయాలి, దీని వలన ప్రైమర్ క్షీణిస్తుంది మరియు క్షీణిస్తుంది.④ ప్రైమర్ యొక్క డిజైన్ అసమంజసమైనది, ఉదాహరణకు ప్రైమర్ యొక్క పొడవు సరిపోదు మరియు ప్రైమర్‌ల మధ్య డి క్లస్టర్ ఏర్పడుతుంది.

Mg2+ఏకాగ్రత: Mg2+ion ఏకాగ్రత PCR యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యంపై గొప్ప ప్రభావాన్ని చూపుతుంది.అధిక ఏకాగ్రత PCR యాంప్లిఫికేషన్ యొక్క వ్యతిరేక లింగాన్ని తగ్గిస్తుంది.ఏకాగ్రత చాలా తక్కువగా ఉంటే, PCR యాంప్లిఫికేషన్ అవుట్‌పుట్ విస్తరణ బ్యాండ్ లేకుండా PCR యాంప్లిఫికేషన్ వైఫల్యాన్ని కూడా చేస్తుంది.

రియాక్షన్ వాల్యూమ్‌లో మార్పు: PCR యాంప్లిఫికేషన్‌లో ఉపయోగించే వాల్యూమ్ 20ul, 30ul, మరియు 50ul లేదా 100uL, PCR యాంప్లిఫికేషన్ కోసం అప్లికేషన్ యొక్క పెద్ద వాల్యూమ్ శాస్త్రీయ పరిశోధన మరియు క్లినికల్ టెస్టింగ్ యొక్క వివిధ ప్రయోజనాల ప్రకారం సెట్ చేయబడింది.20ul వంటి చిన్న వాల్యూమ్‌లను తయారు చేసిన తర్వాత, పరిమాణాన్ని తయారు చేసేటప్పుడు త్రాడు పరిస్థితిని తయారు చేయడం అవసరం, లేకుంటే అది విఫలమవుతుంది.

భౌతిక కారణాలు: PCR విస్తరణకు పరివర్తన చాలా ముఖ్యమైనది.క్షీణత ఉష్ణోగ్రత తక్కువగా ఉంటే, క్షీణత సమయం తక్కువగా ఉంటుంది, ఇది తప్పుడు ప్రతికూలతలలో సంభవించే అవకాశం ఉంది;చాలా తక్కువ ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్‌కు కారణమవుతుంది మరియు నిర్దిష్ట యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని తగ్గిస్తుంది.PCR యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని తగ్గించడానికి ప్రైమర్‌లు మరియు టెంప్లేట్‌ల కలయికను ఎక్కువగా ప్రభావితం చేస్తుంది.కొన్నిసార్లు పొడిగింపు లేదా నీటిలో కరిగే కుక్కర్‌లో వైవిధ్యం, ఎనియలింగ్ మరియు పొడిగించిన ఉష్ణోగ్రతను గుర్తించడానికి ప్రామాణిక థర్మామీటర్‌లను ఉపయోగించడం అవసరం, ఇది PCR వైఫల్యానికి కారణాల్లో ఒకటి.

లక్ష్య శ్రేణి వేరియంట్‌లు: లక్ష్య శ్రేణి సంభవించినట్లయితే, ఒక మ్యుటేషన్ లేదా తొలగింపు, ప్రోటోటైప్ మరియు టెంప్లేట్ కలయిక కలిపితే లేదా లక్ష్య శ్రేణి లేకపోవడం వల్ల, ప్రైమర్ మరియు టెంప్లేట్ పరిపూరకరమైన క్రమాన్ని కోల్పోతాయి మరియు దాని PCR విస్తరణ విజయవంతం కాదు.

● ఫాల్స్ పాజిటివ్

PCR యాంప్లిఫికేషన్ బ్యాండ్ టార్గెట్ సీక్వెన్స్ బ్యాండ్‌కు అనుగుణంగా కనిపిస్తుంది మరియు కొన్నిసార్లు దాని బ్యాండ్ మరింత చక్కగా మరియు ఎక్కువగా ఉంటుంది.

ప్రైమర్ డిజైన్ సముచితం కాదు: ఎంచుకున్న యాంప్లిఫికేషన్ సీక్వెన్స్ మరియు నాన్-పర్పస్ యాంప్లిఫికేషన్ సీక్వెన్స్ సజాతీయంగా ఉంటాయి, కాబట్టి PCR యాంప్లిఫికేషన్ చేసినప్పుడు, యాంప్లిఫైడ్ PCR ఉత్పత్తులు నాన్-పర్పస్ఫుల్ సీక్వెన్స్‌లు.లక్ష్య శ్రేణి చాలా చిన్నది లేదా ప్రైమర్ చాలా చిన్నది మరియు ఇది తప్పుడు పాజిటివ్‌కు అవకాశం ఉంది.రీడిజైన్ చేయాలి.

లక్ష్య శ్రేణి లేదా యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తుల యొక్క క్రాస్ పొల్యూషన్: ఈ కాలుష్యానికి రెండు కారణాలు ఉన్నాయి: మొదటిది, మొత్తం జీనోమ్ లేదా పెద్ద విభాగాల క్రాస్-కాలుష్యం, తప్పుడు పాజిటివ్‌లకు దారి తీస్తుంది.ఈ రకమైన తప్పుడు సానుకూలతను క్రింది పద్ధతుల ద్వారా పరిష్కరించవచ్చు: లక్ష్య క్రమాన్ని నమూనా తుపాకీలోకి పీల్చకుండా లేదా సెంట్రిఫ్యూగల్ ట్యూబ్ నుండి స్ప్లాష్ చేయకుండా నిరోధించడానికి ఆపరేషన్ సమయంలో జాగ్రత్తగా మరియు సున్నితంగా ఉండండి.అధిక ఉష్ణోగ్రతలను తట్టుకోలేని ఎంజైమ్‌లు మరియు పదార్థాలు మినహా, అన్ని కారకాలు లేదా పరికరాలను అధిక పీడనంతో క్రిమిసంహారక చేయాలి.సెంట్రిఫ్యూగల్ పైపులు మరియు నమూనాలను ఒకేసారి ఉపయోగించాలి.అవసరమైనప్పుడు, నమూనాలను జోడించే ముందు, ఇప్పటికే ఉన్న న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాన్ని నాశనం చేయడానికి రియాక్షన్ ట్యూబ్ మరియు రియాజెంట్ అతినీలలోహిత కిరణాలకు గురవుతాయి.రెండవది, వాయు కాలుష్యంలో చిన్న శకలాలు.ఈ చిన్న శకలాలు లక్ష్య శ్రేణి కంటే తక్కువగా ఉంటాయి, కానీ అవి నిర్దిష్ట హోమోలజీని కలిగి ఉంటాయి.ఇది ఒకదానితో ఒకటి విడదీయవచ్చు.ప్రైమర్‌లను పూర్తి చేసిన తర్వాత, PCR ఉత్పత్తిని విస్తరించవచ్చు, ఇది తప్పుడు సానుకూల ఉత్పత్తికి కారణమవుతుంది.ఇది గూడు PCR పద్ధతిని తగ్గించడానికి లేదా తొలగించడానికి ఉపయోగించవచ్చు.

● నాన్‌స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ బ్యాండ్ కనిపిస్తుంది

PCR యాంప్లిఫికేషన్ తర్వాత కనిపించిన బ్యాండ్‌లు ఊహించిన పరిమాణం లేదా పెద్దవి లేదా చిన్నవి లేదా అదే సమయంలో లేదా అదే సమయంలో నిర్దిష్ట యాంప్లిఫికేషన్ బ్యాండ్‌లు మరియు నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ బ్యాండ్‌లకు భిన్నంగా ఉంటాయి.నాన్-స్పెసిఫిక్ బ్యాండ్‌ల ఆవిర్భావం: ముందుగా, ప్రైమర్‌లు లక్ష్య శ్రేణికి అసంపూర్ణంగా ఉంటాయి లేదా డై క్లస్టర్‌ను ఏర్పరచడానికి ప్రైమర్ యొక్క పాలిమరైజేషన్.రెండవది ఏమిటంటే, MG2+అయాన్‌ల సాంద్రత చాలా ఎక్కువగా ఉంది, ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత చాలా తక్కువగా ఉంది మరియు PCR చక్రాల సంఖ్యకు సంబంధించినది.రెండవది, ఎంజైమ్‌ల నాణ్యత మరియు మొత్తం.తరచుగా, కొన్ని మూలాల ఎంజైమ్‌లు నాన్-స్పెషల్ బ్యాండ్‌లకు గురవుతాయి మరియు ఇతర మూలం యొక్క ఎంజైమ్‌లు సంభవించవు.కొన్నిసార్లు ఎంజైమ్‌ల యొక్క నిర్దిష్ట-కాని విస్తరణ కూడా జరుగుతుంది.ప్రతిఘటనలు: అవసరమైతే తిరిగి రూపొందించబడిన ఆకర్షణీయమైనవి.ఎంజైమ్ మొత్తాన్ని తగ్గించండి లేదా మరొక మూలం యొక్క ఎంజైమ్‌ను భర్తీ చేయండి.ప్రాథమిక మొత్తాన్ని తగ్గించండి, తగిన విధంగా టెంప్లేట్‌ల మొత్తాన్ని పెంచండి మరియు చక్రాల సంఖ్యను తగ్గించండి.ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను సరిగ్గా పెంచండి లేదా రెండు ఉష్ణోగ్రత పాయింట్ పద్ధతిని ఉపయోగించండి (93°C క్షీణత, ఎనియలింగ్ మరియు దాదాపు 65°C వద్ద విస్తరించడం).

● ఫ్లాకీ టో లేదా స్మెర్ టేప్ కనిపిస్తుంది

PCR యాంప్లిఫికేషన్ కొన్నిసార్లు వర్తించబడుతుంది లేదా షెల్డ్ లేదా కార్పెట్ లాంటి బెల్ట్ కనిపిస్తుంది.కారణం, ఎంజైమ్‌ల అధిక మొత్తం లేదా ఎంజైమ్ నాణ్యత లేని కారణంగా, dNTP గాఢత చాలా ఎక్కువగా ఉంటుంది, Mg2+ గాఢత చాలా ఎక్కువగా ఉంటుంది, ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత చాలా తక్కువగా ఉంటుంది మరియు చక్రాల సంఖ్య చాలా ఎక్కువగా ఉంటుంది.ప్రతిఘటనలు: ①ఎంజైమ్‌ల మొత్తాన్ని తగ్గించడం లేదా మరొక మూలం యొక్క ఎంజైమ్‌ను మార్చడం.②dNTP యొక్క గాఢతను తగ్గించండి ③Mg2+ గాఢతను సరిగ్గా తగ్గించండి.④ టెంప్లేట్‌ల పరిమాణాన్ని పెంచండి మరియు చక్రాల సంఖ్యను తగ్గించండి.

సంబంధిత ఉత్పత్తులు

PCR Heroᴹ (రంగుతో)

◮ అధిక విశ్వసనీయత: సాధారణ టాక్ ఎంజైమ్ కంటే 6 రెట్లు;

◮ వేగవంతమైన యాంప్లిఫికేషన్ వేగం

◮ మరింత టెంప్లేట్ అనుకూలత

◮ అధిక యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం

◮ పర్యావరణ సహనం బలంగా ఉంది: 37°C వద్ద ఒక వారం పాటు ఉంచబడుతుంది, 90% కంటే ఎక్కువ కార్యాచరణను నిర్వహిస్తుంది;

◮ ఇది 3'→5' ఎక్సోన్యూకలీస్ యాక్టివిటీ లేకుండా 5'→3' DNA పాలిమరేస్ యాక్టివిటీ మరియు 5'→3' ఎక్సోన్యూకలీస్ యాక్టివిటీని కలిగి ఉంది.

PCR సులభం (రంగుతో)

ప్రత్యేకమైన రియాక్షన్ సిస్టమ్ మరియు హై-ఎఫిషియెన్సీ టాక్ DNA పాలిమరేస్ PCR రియాక్షన్‌ని అధిక యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం, ​​ప్రత్యేకత మరియు సున్నితత్వం కలిగి ఉండేలా చేస్తుంది.

RT-qPCR ఈజీ (ఒక దశ)-SYBR గ్రీన్ I

◮ వన్-స్టెప్ కిట్ ఒకే ట్యూబ్‌లో రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ మరియు qPCR రెండు రియాక్షన్‌లను చేస్తుంది, టెంప్లేట్ RNA, నిర్దిష్ట PCR ప్రైమర్‌లు మరియు RNase-ఫ్రీ ddH మాత్రమే జోడించాలి₂O.

◮ కిట్ వైరల్ RNAను త్వరగా మరియు సమర్ధవంతంగా పరిమాణాత్మకంగా విశ్లేషించగలదు లేదా RNAని గుర్తించగలదు.

◮ కిట్ విశిష్టమైన ఫోర్జీన్ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ రియాజెంట్‌ని ఉపయోగిస్తుంది మరియు రియాక్షన్ యొక్క యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని మరియు నిర్దిష్టతను ప్రభావవంతంగా మెరుగుపరచడానికి ఒక ప్రత్యేకమైన రియాక్షన్ సిస్టమ్‌తో కలిపి ఫోర్‌జీన్ హాట్‌స్టార్ టాక్ DNA పాలిమరేస్‌ను ఉపయోగిస్తుంది.

◮ ఆప్టిమైజ్ చేసిన రియాక్షన్ సిస్టమ్ రియాక్షన్‌కి అధిక గుర్తింపు సున్నితత్వం, బలమైన ఉష్ణ స్థిరత్వం మరియు మెరుగైన సహనం కలిగి ఉండేలా చేస్తుంది.

◮ RT-qPCR సులభం^TM(ఒక దశ)-SYBR గ్రీన్ I కిట్ ROX ఇంటర్నల్ రిఫరెన్స్ డైతో వస్తుంది, ఇది సిగ్నల్ బ్యాక్‌గ్రౌండ్ మరియు బావుల మధ్య సిగ్నల్ ఎర్రర్‌లను తొలగించడానికి ఉపయోగపడుతుంది, ఇది కస్టమర్‌లు వివిధ మోడళ్ల పరిమాణాత్మక PCR పరికరాలలో ఉపయోగించడానికి సౌకర్యంగా ఉంటుంది.

RT ఈజీ^TMII (దీనికి మాస్టర్ ప్రీమిక్స్ మొదటి స్ట్రాండ్ cDNA సంశ్లేషణరియల్ టైమ్ PCR)

-2 నిమిషాల్లో టెంప్లేట్‌లోని gDNAని తీసివేయగలిగే gDNAని తొలగించగల సమర్థ సామర్థ్యం.

-సమర్థవంతమైన రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సిస్టమ్, మొదటి స్ట్రాండ్ cDNA సంశ్లేషణను పూర్తి చేయడానికి 15 నిమిషాలు మాత్రమే పడుతుంది.

-కాంప్లెక్స్ టెంప్లేట్‌లు: అధిక GC కంటెంట్ మరియు కాంప్లెక్స్ సెకండరీ స్ట్రక్చర్ ఉన్న టెంప్లేట్‌లను కూడా అధిక సామర్థ్యంతో రివర్స్ చేయవచ్చు.

-హై-సెన్సిటివిటీ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సిస్టమ్, pg-స్థాయి టెంప్లేట్‌లు కూడా అధిక-నాణ్యత cDNAని పొందవచ్చు.

-రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సిస్టమ్ అధిక ఉష్ణ స్థిరత్వాన్ని కలిగి ఉంది, సరైన ప్రతిచర్య ఉష్ణోగ్రత 42℃, మరియు ఇది ఇప్పటికీ 50℃ వద్ద మంచి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ పనితీరును కలిగి ఉంది.