RT-qPCR అనేది మాలిక్యులర్ బయాలజీ యొక్క ప్రాథమిక ప్రయోగం, మరియు ప్రతి ఒక్కరూ దానితో తప్పనిసరిగా తెలిసి ఉండాలి.ఇది ప్రధానంగా మూడు దశలను కలిగి ఉంటుంది: RNA వెలికితీత, cDNAలోకి రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ మరియు నిజ-సమయ ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR.ఇది సహాయం చేయదు, ఏమి జరుగుతోంది?ఇందులో సమస్య ఉండే అవకాశం ఉందిరివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ప్రయోగం!రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ప్రయోగానికి RNA, dNTP, ప్రైమర్‌లు మరియురివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్టేజ్సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌కు మరియు బాగా కలపండి, కానీ అసలు ఆపరేషన్ ప్రక్రియలో, శ్రద్ధ వహించాల్సిన అనేక వివరాలు ఇంకా ఉన్నాయి.దాని గురించి తెలుసుకుందాం!

RNA నాణ్యతను ఎలా అంచనా వేయాలి?
cDNA పొందాలంటే, RNA నాణ్యత చాలా కీలకం!RNA నాణ్యతను ప్రధానంగా రెండు అంశాల నుండి గుర్తించవచ్చు:
(1) RNA సమగ్రత:RNA సమగ్రతను అగరోజ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా ధృవీకరించవచ్చు. యూకారియోట్‌లను ఉదాహరణగా తీసుకుంటే, పూర్తి మొత్తం RNA మూడు స్పష్టమైన బ్యాండ్‌లను కలిగి ఉంటుంది, పెద్ద నుండి చిన్న వరకు పరమాణు బరువులు 28S, 18S మరియు 5S, మరియు 28S 18S కంటే రెండు రెట్లు ప్రకాశవంతంగా ఉంటుంది;మూడు బ్యాండ్‌లను చూడగలిగితే, కానీ బ్యాండ్ రకం అస్పష్టంగా ఉంటే లేదా డిఫ్యూజన్ అంటే RNA పాక్షికంగా క్షీణించబడిందని అర్థం.ఈ సమయంలో, దయచేసి వెంటనే రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ రియాక్షన్‌ని అమలు చేయండి మరియు టెంప్లేట్ ఇన్‌పుట్‌ను తగిన విధంగా పెంచండి;ఒక చిన్న మాలిక్యులర్ బరువు లేదా బ్యాండ్ లేని బ్యాండ్ మాత్రమే కనిపించినట్లయితే, RNA పూర్తిగా క్షీణించింది మరియు తిరిగి వెలికితీయవలసి ఉంటుంది.ఎజిలెంట్ 2100 గరిష్ట రేఖాచిత్రం మరియు RIN విలువతో RNA యొక్క సమగ్రతను సూచిస్తుంది.న్యూక్లియిక్ ఆమ్లం చెక్కుచెదరకుండా ఉంటే, ఎలెక్ట్రోఫెరోగ్రామ్ యొక్క బేస్లైన్ ఫ్లాట్గా ఉంటుంది;న్యూక్లియిక్ ఆమ్లం తీవ్రంగా క్షీణించినట్లయితే, బేస్లైన్ అసమానంగా ఉంటుంది మరియు మరింత క్షీణత శిఖరాలు కనిపిస్తాయి;RIN విలువ RNA యొక్క సమగ్రతను ప్రతిబింబిస్తుంది, 0-10 పరిధిలో, పెద్ద విలువ, RNA నాణ్యత మెరుగ్గా ఉంటుంది.బాగా, పరిపూర్ణత యొక్క అధిక డిగ్రీ.
(2) RNA యొక్క స్వచ్ఛత:OD260/280 నిష్పత్తిని UV స్పెక్ట్రోఫోటోమెట్రీ ద్వారా గుర్తించవచ్చు.OD260/280 నిష్పత్తి 1.9 మరియు 2.1 మధ్య ఉంటే, స్వచ్ఛత చాలా మంచిది.
అవశేష జన్యుసంబంధమైన DNA సరికాని పరిమాణాత్మక ఫలితాలకు దారి తీస్తుంది
RNA సంగ్రహించబడినప్పుడు, మనకు లభించే RNA శుభ్రపరచబడని జన్యుసంబంధమైన DNA (gDNA)తో మిళితం కావచ్చు.అందువల్ల, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ తర్వాత cDNA కూడా కలపబడుతుందిgDNA.దిగువ సమయంలోqPCRస్పందన,cDNAమరియు gDNA ఏకకాలంలో విస్తరించబడవచ్చు, దీని ఫలితంగా సాపేక్షంగా చిన్న CT విలువ ఉంటుంది, కాబట్టి ఫలితాలు పక్షపాతంగా ఉండవచ్చు.
కాబట్టి ఈ పరిస్థితిలో మనం ఏమి చేయాలి?ఫోర్జీన్సూచిస్తుంది:
(1) RNA వెలికితీత సమయంలో కాలమ్ వెలికితీత ద్వారా తొలగించబడే రివర్స్డ్ RNAపై జీనోమ్ క్లీనింగ్ చేయండి;
(2) సంగ్రహించిన RNAని DNaseతో చికిత్స చేయండిI , కానీ దానిని EDTAతో ముగించండి;
రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ రియాజెంట్స్జీనోమ్ క్లియరింగ్ మాడ్యూల్స్‌తో;

రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కోసం ప్రైమర్లను ఎలా ఎంచుకోవాలి?
రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ప్రైమర్‌లు రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ రియాక్షన్ ఫలితాన్ని కూడా ప్రభావితం చేస్తాయి.మీరు ప్రయోగం యొక్క నిర్దిష్ట పరిస్థితులకు అనుగుణంగా రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కోసం యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్‌లు, ఒలిగో డిటి లేదా జన్యు-నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌లను ఎంచుకోవచ్చు:
(1) నిర్దిష్ట లిప్యంతరీకరణలు: జన్యు-నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌లు సిఫార్సు చేయబడ్డాయి;
(2) లాంగ్ ఫ్రాగ్మెంట్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్స్: ఒలిగో డిటి/జీన్-నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌లు సిఫార్సు చేయబడ్డాయి;
(3) లాంగ్-సెగ్మెంట్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్స్ యొక్క అంతర్గత శకలాలు: జన్యు-నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌లు/ యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్‌లు/రాండమ్ ప్రైమర్‌లు + ఒలిగో డిటి.తదుపరి qPCR ప్రయోగం జరిగితే, ఒలిగో dT ఒంటరిగా ఉపయోగించబడదు, ఎందుకంటే ఒలిగో dT మాత్రమే ఉపయోగించడం వలన 3′ ముగింపు పక్షపాతం ఏర్పడవచ్చు, ఇది సరికాని qPCR ప్రయోగ ఫలితాలకు దారితీస్తుంది;
(4) miRNA: స్టెమ్-లూప్ ప్రైమర్‌లు లేదా టైలింగ్ ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించవచ్చు.

పరిమాణీకరణ కోసం రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ఉత్పత్తి cDNA ఎన్ని సార్లు పలుచన చేయాలి?
రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ఉత్పత్తి యొక్క cDNA పొందిన తర్వాత, qPCR ప్రయోగాల కోసం cDNA ఎన్ని సార్లు పలుచన చేయాలి అనేది చాలా ముఖ్యమైనది.cDNA గాఢత చాలా ఎక్కువ లేదా చాలా తక్కువగా ఉంటే, యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం ప్రభావితం కావచ్చు.cDNA ఏకాగ్రతను కొలవవచ్చు మరియు అది ఎలా చేయాలి?
(1) రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ఉత్పత్తి యొక్క cDNA గాఢతను కొలవలేము, ఎందుకంటే cDNA ఉత్పత్తికి అదనంగా, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ఉత్పత్తిలో రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ అవశేష బఫర్, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్, ప్రైమర్‌లు మొదలైనవి కూడా ఉంటాయి, ఇది ఏకాగ్రత కొలత ఫలితాలకు ఆటంకం కలిగిస్తుంది మరియు OD/260260/280260 నిజమైన cDNA దిగుబడిని ప్రతిబింబిస్తుంది.ఈ సమయంలో, కొంతమంది స్నేహితులు చెబుతారు, అప్పుడు నేను శుద్ధి చేసిన తర్వాత ఏకాగ్రతను కొలుస్తాను;ఇక్కడ, సిడిఎన్ఎను శుద్ధి చేయమని సిఫార్సు చేయలేదని ఫోర్జీన్ గుర్తు చేయాలనుకుంటున్నారు, ఎందుకంటే రివర్సల్ ద్వారా పొందిన సిడిఎన్ఎ పొడవు భిన్నంగా ఉంటుంది మరియు శుద్దీకరణలో చిన్న సిడిఎన్ఎ పోతుంది.
(2) కాబట్టి ఏమి చేయాలి?qPCR ప్రయోగానికి ముందు, cDNA యొక్క పలుచన ప్రవణతను ముందస్తు ప్రయోగం ద్వారా నిర్ణయించవచ్చు.ఉదాహరణకు: qPCR ప్రయోగాల కోసం cDNA స్టాక్ సొల్యూషన్, 10 రెట్లు పలుచన మరియు 100 రెట్లు పలుచనను టెంప్లేట్‌లుగా ఉపయోగించండి మరియు 18-28 పరిధిలో CT విలువతో పలుచన కారకాన్ని ఎంచుకోండి.

miRNAలను ఎలా రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్ చేయాలి?
miRNA అనేది ప్రోటీన్ కోసం కోడ్ చేయని దాదాపు 22 nt సైజు కలిగిన ఒక సింగిల్ స్ట్రాండెడ్ చిన్న మాలిక్యూల్ RNA.తక్కువ పొడవు ఉన్నందున, సాంప్రదాయిక qPCR పద్ధతి దానిని నేరుగా లెక్కించడం కష్టం, కాబట్టి ఇది తరచుగా miRNAని పొడిగించడం అవసరం;miRNA కోసం సాధారణంగా ఉపయోగించే రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ పద్ధతులలో స్టెమ్-లూప్ పద్ధతి మరియు టైలింగ్ పద్ధతి ఉన్నాయి.
స్టెమ్-లూప్ ప్రైమర్‌లను జోడించడం ద్వారా miRNAని విస్తరించడం స్టెమ్-లూప్ పద్ధతి.ఈ గుర్తింపు పద్ధతి అధిక సున్నితత్వం మరియు విశిష్టతను కలిగి ఉంది, కానీ గుర్తించే నిర్గమాంశం తక్కువగా ఉంటుంది.ఒక రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ఒక miRNA మరియు అంతర్గత సూచనను మాత్రమే గుర్తించగలదు;తోక-జోడించే పద్ధతి రెండింటిని కలిగి ఉంటుంది, ఇది రెండు ఎంజైమ్‌ల ఉమ్మడి చర్య ద్వారా పూర్తవుతుంది, అవి PolyA పాలిమరేస్ మరియు రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్.PolyA పాలిమరేస్ దాని పొడవును పెంచడానికి miRNAకి PolyA తోకలను జోడించడానికి బాధ్యత వహిస్తుంది మరియు రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ప్రతిచర్యను నిర్వహిస్తుంది.ఈ పద్ధతి అధిక గుర్తింపు నిర్గమాంశను కలిగి ఉంది మరియు ఒక రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌లో బహుళ miRNAలు మరియు అంతర్గత సూచనలను గుర్తించగలదు, అయితే స్టెమ్-లూప్ పద్ధతిలో సున్నితత్వం మరియు నిర్దిష్టత తక్కువగా ఉంటాయి.