రియల్ టైమ్ PCR, క్వాంటిటేటివ్ PCR లేదా qPCR అని కూడా పిలుస్తారు, ఇది PCR యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తుల యొక్క నిజ-సమయ పర్యవేక్షణ మరియు విశ్లేషణ కోసం ఒక పద్ధతి.
క్వాంటిటేటివ్ PCR సాధారణ ఆపరేషన్, వేగవంతమైన మరియు అనుకూలమైన, అధిక సున్నితత్వం, మంచి పునరావృతత మరియు తక్కువ కాలుష్యం యొక్క ప్రయోజనాలను కలిగి ఉన్నందున, ఇది వైద్య పరీక్ష, ఔషధ సమర్థత అంచనా, జన్యు వ్యక్తీకరణ పరిశోధన, జన్యుమార్పిడి పరిశోధన, జన్యు గుర్తింపు, వ్యాధికారక గుర్తింపు, జంతువు మరియు మొక్కల గుర్తింపులో విస్తృతంగా ఉపయోగించబడుతుంది., ఆహార పరీక్ష మరియు ఇతర రంగాలు.
అందువల్ల, మీరు లైఫ్ సైన్సెస్‌లో ప్రాథమిక పరిశోధనలో నిమగ్నమై ఉన్నా, లేదా ఫార్మాస్యూటికల్ కంపెనీలు, పశుసంవర్ధక సంస్థలు, ఫుడ్ కంపెనీల ఉద్యోగులు లేదా ఎంట్రీ-ఎగ్జిట్ ఇన్‌స్పెక్షన్ మరియు క్వారంటైన్ బ్యూరోలు, ఎన్విరాన్‌మెంటల్ మానిటరింగ్ డిపార్ట్‌మెంట్‌లు, ఆసుపత్రులు మరియు ఇతర యూనిట్ల ఉద్యోగులు అయినా, మీరు ఎక్కువ లేదా తక్కువ బహిర్గతం అవుతారు లేదా PCR క్వాంటిటేటివ్ పరిజ్ఞానం తెలుసుకోవాలి.

రియల్ టైమ్ PCR సూత్రం

రియల్ టైమ్ PCR అనేది PCR ప్రతిచర్య వ్యవస్థకు ఫ్లోరోసెంట్ పదార్థాలు జోడించబడే ఒక పద్ధతి, మరియు PCR ప్రతిచర్య ప్రక్రియలో ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్ తీవ్రత పరిమాణాత్మక PCR పరికరం ద్వారా నిజ సమయంలో పర్యవేక్షించబడుతుంది మరియు చివరకు ప్రయోగాత్మక డేటా విశ్లేషించబడుతుంది మరియు ప్రాసెస్ చేయబడుతుంది.

【యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్】PCR యొక్క డైనమిక్ ప్రక్రియను వివరించే వక్రరేఖ.PCR యొక్క యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్ వాస్తవానికి ప్రామాణిక ఘాతాంక వక్రరేఖ కాదు, కానీ సిగ్మోయిడ్ కర్వ్.

[యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్ యొక్క ప్లాట్‌ఫారమ్ దశ]PCR చక్రాల సంఖ్య పెరుగుదల, DNA పాలిమరేస్ యొక్క క్రియారహితం, dNTPలు మరియు ప్రైమర్‌ల క్షీణత మరియు ప్రతిచర్య ఉప-ఉత్పత్తి పైరోఫాస్ఫేట్ మొదలైన వాటి ద్వారా సంశ్లేషణ ప్రతిచర్యను నిరోధించడం, PCR ఎల్లప్పుడూ విపరీతంగా విస్తరించదు., మరియు చివరికి పీఠభూమిలోకి ప్రవేశిస్తుంది.

[ఎక్స్‌పోనెన్షియల్ గ్రోత్ రీజియన్ ఆఫ్ యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్]పీఠభూమి దశ చాలా మారుతూ ఉన్నప్పటికీ, యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్ యొక్క ఘాతాంక పెరుగుదల ప్రాంతంలోని నిర్దిష్ట ప్రాంతంలో, పునరావృతత చాలా మంచిది, ఇది PCR యొక్క పరిమాణాత్మక విశ్లేషణకు చాలా ముఖ్యమైనది.

[థ్రెషోల్డ్ విలువ మరియు Ct విలువ]మేము ఫ్లోరోసెన్స్ డిటెక్షన్ యొక్క పరిమితి విలువను యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్ యొక్క ఎక్స్‌పోనెన్షియల్ గ్రోత్ ఏరియాలో తగిన స్థానంలో సెట్ చేసాము, అవి థ్రెషోల్డ్ విలువ (థ్రెషోల్డ్).థ్రెషోల్డ్ విలువ మరియు యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్ యొక్క ఖండన అనేది Ct విలువ, అనగా, Ct విలువ థ్రెషోల్డ్ విలువను చేరుకున్నప్పుడు చక్రాల సంఖ్యను (థ్రెషోల్డ్ సైకిల్) సూచిస్తుంది.

దిగువ గ్రాఫ్ థ్రెషోల్డ్ లైన్ మరియు యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్, థ్రెషోల్డ్ మరియు Ct విలువ మధ్య సంబంధాన్ని స్పష్టంగా చూపుతుంది.

【ఎలా లెక్కించాలి?】

Ct విలువ ప్రారంభ టెంప్లేట్‌ల సంఖ్య యొక్క సంవర్గమానంతో విలోమ సరళ సంబంధాన్ని కలిగి ఉందని గణిత సిద్ధాంతం ద్వారా నిరూపించబడింది.రియల్ టైమ్ PCR PCR యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తులను నిజ సమయంలో పర్యవేక్షిస్తుంది మరియు ఎక్స్‌పోనెన్షియల్ యాంప్లిఫికేషన్ దశలో వాటిని గణిస్తుంది.

PCR యొక్క ప్రతి చక్రం కోసం, DNA విపరీతంగా 2 రెట్లు పెరిగింది మరియు త్వరలో ఒక పీఠభూమికి చేరుకుంది.

ప్రారంభ DNA మొత్తం A అని ఊహిస్తే₀ , n చక్రాల తర్వాత, DNA ఉత్పత్తి యొక్క సైద్ధాంతిక మొత్తాన్ని ఇలా వ్యక్తీకరించవచ్చు:

A _n =A ₀ × 2ⁿ

అప్పుడు, ప్రారంభ DNA మొత్తం A 0 అయితే, ఆమ్ప్లిఫైడ్ ప్రొడక్ట్ మొత్తం త్వరగా గుర్తింపు విలువను చేరుకుంటుంది మరియు An చేరుకునేటప్పుడు చక్రాల సంఖ్య Ct విలువ.అంటే, ప్రారంభ DNA మొత్తం A 0 ఎంత ఎక్కువగా ఉంటే, అంతకు ముందు యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్ పీక్స్, మరియు తదనుగుణంగా అవసరమైన సైకిల్స్ n సంఖ్య తక్కువగా ఉంటుంది.

మేము తెలిసిన ఏకాగ్రత యొక్క ప్రమాణం యొక్క గ్రేడియంట్ డైల్యూషన్‌ను నిర్వహిస్తాము మరియు దానిని రియల్ టైమ్ PCR కోసం టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగిస్తాము మరియు DNA మొత్తాన్ని ఎక్కువ నుండి తక్కువకు ప్రారంభించే క్రమంలో సమాన వ్యవధిలో విస్తరణ వక్రరేఖల శ్రేణిని పొందవచ్చు.Ct విలువ మరియు ప్రారంభ టెంప్లేట్‌ల సంఖ్య యొక్క లాగరిథమ్ మధ్య సరళ సంబంధం ప్రకారం, a[ప్రామాణిక వక్రత] సృష్టించవచ్చు .

నమూనా యొక్క Ct విలువను తెలియని ఏకాగ్రతతో ప్రామాణిక వక్రరేఖలోకి మార్చడం ద్వారా, తెలియని ఏకాగ్రతతో నమూనా యొక్క ప్రారంభ టెంప్లేట్ మొత్తాన్ని పొందవచ్చు, ఇది రియల్ టైమ్ PCR యొక్క పరిమాణాత్మక సూత్రం.

రియల్ టైమ్ PCR యొక్క గుర్తింపు పద్ధతి

రియాక్షన్ సిస్టమ్‌లోని ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రతను గుర్తించడం ద్వారా రియల్ టైమ్ PCR PCR యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తులను గుర్తిస్తుంది.

ఫ్లోరోసెంట్ డై ఎంబెడ్డింగ్ పద్ధతి యొక్క సూత్రం】

ఫ్లోరోసెంట్ రంగులు, TB గ్రీన్ ® వంటివి, PCR సిస్టమ్‌లలో డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNAకి నిర్ధిష్టంగా బంధించగలవు మరియు బైండింగ్ తర్వాత ఫ్లోరోస్ అవుతాయి.

PCR చక్రాల పెరుగుదలతో ప్రతిచర్య వ్యవస్థలో ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రత విపరీతంగా పెరిగింది.ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రతను గుర్తించడం ద్వారా, రియాక్షన్ సిస్టమ్‌లోని DNA యాంప్లిఫికేషన్ మొత్తాన్ని నిజ సమయంలో పర్యవేక్షించవచ్చు, ఆపై నమూనాలోని ప్రారంభ టెంప్లేట్ మొత్తాన్ని రివర్స్‌గా అంచనా వేయవచ్చు.

【ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్ పద్ధతి యొక్క సూత్రం】

ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్5′ చివరన ఫ్లోరోసెంట్ సమూహం మరియు 3′ చివరన క్వెన్చింగ్ గ్రూప్‌తో కూడిన న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ సీక్వెన్స్, ఇది ప్రత్యేకంగా టెంప్లేట్‌కు కట్టుబడి ఉంటుంది.ప్రోబ్ చెక్కుచెదరకుండా ఉన్నప్పుడు, ఫ్లోరోఫోర్ ద్వారా విడుదలయ్యే ఫ్లోరోసెన్స్ చల్లార్చే సమూహం ద్వారా చల్లబడుతుంది మరియు ఫ్లోరోస్ చేయదు.ప్రోబ్ కుళ్ళిపోయినప్పుడు, ఫ్లోరోసెంట్ పదార్ధం విడదీయబడుతుంది మరియు ఫ్లోరోసెన్స్‌ను విడుదల చేస్తుంది.

PCR రియాక్షన్ సొల్యూషన్‌కు ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్ జోడించబడింది.ఎనియలింగ్ ప్రక్రియలో, ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్ టెంప్లేట్ యొక్క నిర్దిష్ట స్థానానికి కట్టుబడి ఉంటుంది.పొడిగింపు ప్రక్రియలో, PCR ఎంజైమ్ యొక్క 5′→3′ ఎక్సోన్యూకలీస్ కార్యాచరణ టెంప్లేట్‌తో హైబ్రిడైజ్ చేయబడిన ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్‌ను విడదీస్తుంది మరియు ఫ్లోరోసెన్స్‌ను విడుదల చేయడానికి ఫ్లోరోసెంట్ పదార్ధం విడదీయబడుతుంది.ప్రతిచర్య వ్యవస్థలో ప్రోబ్ యొక్క ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రతను గుర్తించడం ద్వారా, PCR ఉత్పత్తి యొక్క యాంప్లిఫికేషన్ మొత్తాన్ని పర్యవేక్షించే ఉద్దేశ్యాన్ని సాధించవచ్చు.

【ఫ్లోరోసెన్స్ డిటెక్షన్ పద్ధతి ఎంపిక】

అధిక హోమోలజీతో సీక్వెన్స్‌లను వేరు చేయడానికి మరియు SNP టైపింగ్ విశ్లేషణ వంటి మల్టీప్లెక్స్ PCR డిటెక్షన్‌ని నిర్వహించడానికి దీనిని ఉపయోగిస్తే, ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్ పద్ధతి భర్తీ చేయలేనిది.
ఇతర రియల్ టైమ్ PCR ప్రయోగాల కోసం, సరళమైన, సులభమైన మరియు తక్కువ-ధరతో కూడిన ఫ్లోరోసెంట్ చిమెరా పద్ధతిని ఉపయోగించవచ్చు.

probesబలమైన నిర్దిష్టత, మల్టీప్లెక్స్ PCR సామర్థ్యం

లోపము

విస్తరణ కోసం అధిక నిర్దిష్టత అవసరాలు;

మల్టీప్లెక్స్ PCR నిర్వహించబడదు నిర్దిష్ట ప్రోబ్స్ రూపకల్పన అవసరం, అధిక ధర;

కొన్నిసార్లు ప్రోబ్ డిజైన్ కష్టం

సంబంధిత ఉత్పత్తులు: