మాలిక్యులర్ డయాగ్నసిస్ టెక్నాలజీ మానవ శరీరం మరియు వివిధ వ్యాధికారక జన్యు పదార్ధం యొక్క వ్యక్తీకరణ మరియు నిర్మాణాన్ని గుర్తించడానికి పరమాణు జీవశాస్త్ర పద్ధతులను ఉపయోగిస్తుంది, తద్వారా వ్యాధులను అంచనా వేయడం మరియు నిర్ధారించడం యొక్క ఉద్దేశ్యాన్ని సాధించవచ్చు.

ఇటీవలి సంవత్సరాలలో, మాలిక్యులర్ డయాగ్నొస్టిక్ టెక్నాలజీని అప్‌గ్రేడ్ చేయడం మరియు పునరావృతం చేయడంతో, మాలిక్యులర్ డయాగ్నస్టిక్స్ యొక్క క్లినికల్ అప్లికేషన్ మరింత విస్తృతంగా మరియు లోతుగా మారింది మరియు మాలిక్యులర్ డయాగ్నస్టిక్స్ మార్కెట్ వేగంగా అభివృద్ధి చెందుతున్న కాలంలోకి ప్రవేశించింది.

రచయిత మార్కెట్‌లోని సాధారణ మాలిక్యులర్ డయాగ్నస్టిక్ టెక్నాలజీలను సంగ్రహించి, మూడు భాగాలుగా విభజించారు: మొదటి భాగం PCR సాంకేతికతను పరిచయం చేస్తుంది, రెండవ భాగం న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ ఐసోథర్మల్ యాంప్లిఫికేషన్ టెక్నాలజీని పరిచయం చేస్తుంది మరియు రెండవ భాగం సీక్వెన్సింగ్ టెక్నాలజీని పరిచయం చేస్తుంది.

01

పార్ట్ I: PCR టెక్నాలజీ

PCR సాంకేతికత

PCR (పాలిమరేస్ చైన్ రియాక్షన్) అనేది 30 సంవత్సరాల కంటే ఎక్కువ చరిత్ర కలిగిన ఇన్ విట్రో DNA యాంప్లిఫికేషన్ టెక్నాలజీలలో ఒకటి.

PCR టెక్నాలజీని 1983లో USAలోని సెటస్‌కు చెందిన కారీ ముల్లిస్ ప్రారంభించారు.ముల్లిస్ 1985లో PCR పేటెంట్ కోసం దరఖాస్తు చేసుకున్నాడు మరియు అదే సంవత్సరంలో సైన్స్‌పై మొదటి PCR అకడమిక్ పేపర్‌ను ప్రచురించాడు.ముల్లిస్ 1993లో రసాయన శాస్త్రంలో నోబెల్ బహుమతిని గెలుచుకున్నాడు.

PCR యొక్క ప్రాథమిక సూత్రాలు

PCR లక్ష్య DNA శకలాలను ఒక మిలియన్ కంటే ఎక్కువ సార్లు విస్తరించగలదు.సూత్రం ఏమిటంటే DNA పాలిమరేస్ ఉత్ప్రేరకము క్రింద, మాతృ స్ట్రాండ్ DNA ఒక టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించబడుతుంది మరియు ఒక నిర్దిష్ట ప్రైమర్ పొడిగింపు కోసం ప్రారంభ బిందువుగా ఉపయోగించబడుతుంది.డీనాటరేషన్, ఎనియలింగ్ మరియు ఎక్స్‌టెన్షన్ వంటి దశల ద్వారా ఇది విట్రోలో ప్రతిరూపం పొందుతుంది.కుమార్తె స్ట్రాండ్ DNA యొక్క ప్రక్రియ మాతృ స్ట్రాండ్ టెంప్లేట్ DNAకి పరిపూరకరమైనది.

ప్రామాణిక PCR ప్రక్రియ మూడు దశలుగా విభజించబడింది:

1. డీనాటరేషన్: DNA డబుల్ స్ట్రాండ్‌లను వేరు చేయడానికి అధిక ఉష్ణోగ్రతను ఉపయోగించండి.DNA డబుల్ స్ట్రాండ్‌ల మధ్య హైడ్రోజన్ బంధాలు అధిక ఉష్ణోగ్రతల వద్ద (93-98°C) విరిగిపోతాయి.

2. ఎనియలింగ్: డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA వేరు చేయబడిన తర్వాత, ఉష్ణోగ్రత తగ్గించబడుతుంది, తద్వారా ప్రైమర్ సింగిల్ స్ట్రాండెడ్ DNAతో బంధించబడుతుంది.

3. పొడిగింపు: DNA పాలిమరేస్ ఉష్ణోగ్రత తగ్గించబడినప్పుడు కట్టుబడి ఉన్న ప్రైమర్‌ల నుండి DNA తంతువుల వెంట పరిపూరకరమైన తంతువులను సంశ్లేషణ చేయడం ప్రారంభిస్తుంది.పొడిగింపు పూర్తయినప్పుడు, ఒక చక్రం పూర్తవుతుంది మరియు DNA శకలాల సంఖ్య రెట్టింపు అవుతుంది.

ఈ మూడు దశలను 25-35 సార్లు పరస్పరం చేస్తే, DNA శకలాలు విపరీతంగా పెరుగుతాయి.

PCR యొక్క చాతుర్యం ఏమిటంటే, విభిన్న లక్ష్య జన్యువుల కోసం వేర్వేరు ప్రైమర్‌లను రూపొందించవచ్చు, తద్వారా లక్ష్య జన్యు శకలాలు తక్కువ వ్యవధిలో విస్తరించబడతాయి.

ఇప్పటివరకు, PCRని సాధారణ PCR, ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCR మరియు డిజిటల్ PCR అని మూడు వర్గాలుగా విభజించవచ్చు.

సాధారణ PCR యొక్క మొదటి తరం

లక్ష్య జన్యువును విస్తరించడానికి ఒక సాధారణ PCR యాంప్లిఫికేషన్ పరికరాన్ని ఉపయోగించండి, ఆపై ఉత్పత్తిని గుర్తించడానికి అగ్రోస్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్‌ను ఉపయోగించండి, గుణాత్మక విశ్లేషణ మాత్రమే చేయబడుతుంది.

మొదటి తరం PCR యొక్క ప్రధాన ప్రతికూలతలు:

-నిర్దిష్ట విస్తరణ మరియు తప్పుడు సానుకూల ఫలితాలకు అవకాశం ఉంది.

-గుర్తింపు చాలా సమయం పడుతుంది మరియు ఆపరేషన్ గజిబిజిగా ఉంటుంది.

- గుణాత్మక పరీక్ష మాత్రమే చేయవచ్చు.

రెండవ తరం ఫ్లోరోసెన్స్ క్వాంటిటేటివ్ PCR

ఫ్లోరోసెన్స్ క్వాంటిటేటివ్ PCR (రియల్-టైమ్ PCR), qPCR అని కూడా పిలుస్తారు, ప్రతిచర్య వ్యవస్థ యొక్క పురోగతిని సూచించే ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్‌లను జోడించడం ద్వారా ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్‌ల చేరడం ద్వారా విస్తరించిన ఉత్పత్తుల చేరడం పర్యవేక్షించడానికి మరియు ప్రామాణిక వక్రరేఖ ద్వారా ఫలితాలను అంచనా వేయడానికి ఉపయోగిస్తారు.

qPCR సాంకేతికత క్లోజ్డ్ సిస్టమ్‌లో నిర్వహించబడుతున్నందున, కాలుష్యం యొక్క సంభావ్యత తగ్గుతుంది మరియు పరిమాణాత్మక గుర్తింపు కోసం ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్‌ను పర్యవేక్షించవచ్చు, కాబట్టి ఇది క్లినికల్ ప్రాక్టీస్‌లో అత్యంత విస్తృతంగా ఉపయోగించబడుతుంది మరియు PCRలో ఆధిపత్య సాంకేతికతగా మారింది.

నిజ-సమయ ఫ్లోరోసెంట్ క్వాంటిటేటివ్ PCRలో ఉపయోగించే ఫ్లోరోసెంట్ పదార్థాలను ఇలా విభజించవచ్చు: TaqMan ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్స్, మాలిక్యులర్ బీకాన్‌లు మరియు ఫ్లోరోసెంట్ డైస్.

1) TaqMan ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్:

PCR యాంప్లిఫికేషన్ సమయంలో, ఒక జత ప్రైమర్‌లను జోడించేటప్పుడు నిర్దిష్ట ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్ జోడించబడుతుంది.ప్రోబ్ ఒక ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్, మరియు రెండు చివరలు వరుసగా రిపోర్టర్ ఫ్లోరోసెంట్ గ్రూప్ మరియు క్వెన్చర్ ఫ్లోరోసెంట్ గ్రూప్‌తో లేబుల్ చేయబడ్డాయి.

ప్రోబ్ చెక్కుచెదరకుండా ఉన్నప్పుడు, రిపోర్టర్ గ్రూప్ ద్వారా విడుదలయ్యే ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్ క్వెన్చింగ్ గ్రూప్ ద్వారా గ్రహించబడుతుంది;PCR యాంప్లిఫికేషన్ సమయంలో, టాక్ ఎంజైమ్ యొక్క 5′-3′ ఎక్సోన్యూకలీస్ చర్య ప్రోబ్‌ను క్లీవ్ చేస్తుంది మరియు క్షీణిస్తుంది, రిపోర్టర్ ఫ్లోరోసెంట్ గ్రూప్ మరియు క్వెన్చర్‌గా చేస్తుంది, ఫ్లోరోసెంట్ గ్రూప్ వేరు చేయబడుతుంది, తద్వారా ఫ్లోరోసెన్స్ మానిటరింగ్ సిస్టమ్ ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్‌ను అందుకోగలదు, అనగా, ప్రతిసారీ డీఎన్‌ఏ ఒక ఫ్లోరోసెన్స్ సంకేతాన్ని పొందుతుంది. ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్ యొక్క లేషన్ PCR ఉత్పత్తి ఏర్పడటంతో పూర్తిగా సమకాలీకరించబడుతుంది.

2) SYBR ఫ్లోరోసెంట్ రంగులు:

PCR ప్రతిచర్య వ్యవస్థలో, SYBR ఫ్లోరోసెంట్ డై అధికంగా జోడించబడుతుంది.SYBR ఫ్లోరోసెంట్ డైని నిర్దిష్టంగా DNA డబుల్ స్ట్రాండ్‌లో చేర్చని తర్వాత, అది ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్‌ను విడుదల చేస్తుంది.గొలుసులో చేర్చబడని SYBR డై మాలిక్యూల్ ఎటువంటి ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్‌ను విడుదల చేయదు, తద్వారా ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్‌ను నిర్ధారిస్తుంది PCR ఉత్పత్తుల పెరుగుదల PCR ఉత్పత్తుల పెరుగుదలతో పూర్తిగా సమకాలీకరించబడుతుంది.SYBR డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNAతో మాత్రమే బంధిస్తుంది, కాబట్టి PCR ప్రతిచర్య నిర్దిష్టంగా ఉందో లేదో తెలుసుకోవడానికి ద్రవీభవన వక్రరేఖను ఉపయోగించవచ్చు.

3) పరమాణు బీకాన్లు

ఇది ఒక స్టెమ్-లూప్ డబుల్-లేబుల్ ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్ ప్రోబ్, ఇది 5 మరియు 3 చివర్లలో సుమారు 8 బేస్‌ల హెయిర్‌పిన్ నిర్మాణాన్ని ఏర్పరుస్తుంది.రెండు చివర్లలోని న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ సీక్వెన్సులు పరిపూరకంగా జతచేయబడతాయి, దీని వలన ఫ్లోరోసెంట్ సమూహం మరియు క్వెన్చింగ్ గ్రూప్ బిగుతుగా ఉంటాయి.దగ్గరగా, ఇది ఫ్లోరోసెన్స్‌ను ఉత్పత్తి చేయదు.

PCR ఉత్పత్తి ఉత్పత్తి చేయబడిన తర్వాత, ఎనియలింగ్ ప్రక్రియలో, పరమాణు బెకన్ యొక్క మధ్య భాగం ఒక నిర్దిష్ట DNA క్రమంతో జత చేయబడుతుంది మరియు ఫ్లోరోసెన్స్‌ను ఉత్పత్తి చేయడానికి ఫ్లోరోసెంట్ జన్యువు క్వెన్చర్ జన్యువు నుండి వేరు చేయబడుతుంది.

రెండవ తరం PCR యొక్క ప్రధాన ప్రతికూలతలు:

సున్నితత్వం ఇప్పటికీ లేదు మరియు తక్కువ-కాపీ నమూనాలను గుర్తించడం ఖచ్చితమైనది కాదు.

నేపథ్య విలువ ప్రభావం ఉంది మరియు ఫలితంగా జోక్యానికి అవకాశం ఉంది.

మూడవ తరం డిజిటల్ PCR

డిజిటల్ PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) లక్ష్య శ్రేణి యొక్క కాపీ సంఖ్యను ముగింపు-పాయింట్ గుర్తింపు ద్వారా గణిస్తుంది మరియు అంతర్గత నియంత్రణలు మరియు ప్రామాణిక వక్రతలను ఉపయోగించకుండా ఖచ్చితమైన సంపూర్ణ పరిమాణాత్మక గుర్తింపును నిర్వహించగలదు.

డిజిటల్ PCR ఎండ్‌పాయింట్ డిటెక్షన్‌ను ఉపయోగిస్తుంది మరియు Ct విలువ (సైకిల్ థ్రెషోల్డ్)పై ఆధారపడదు, కాబట్టి డిజిటల్ PCR ప్రతిచర్య యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం ద్వారా తక్కువగా ప్రభావితమవుతుంది మరియు PCR ప్రతిచర్య నిరోధకాలకు సహనం అధిక ఖచ్చితత్వం మరియు పునరుత్పత్తితో మెరుగుపడుతుంది.

అధిక సున్నితత్వం మరియు అధిక ఖచ్చితత్వం యొక్క లక్షణాల కారణంగా, ఇది PCR ప్రతిచర్య నిరోధకాలచే సులభంగా జోక్యం చేసుకోదు మరియు ఇది పరిశోధన మరియు అప్లికేషన్ హాట్‌స్పాట్‌గా మారిన ప్రామాణిక ఉత్పత్తులు లేకుండా నిజమైన సంపూర్ణ పరిమాణాన్ని సాధించగలదు.

ప్రతిచర్య యూనిట్ యొక్క వివిధ రూపాల ప్రకారం, దీనిని మూడు రకాలుగా విభజించవచ్చు: మైక్రోఫ్లూయిడ్, చిప్ మరియు బిందు వ్యవస్థలు.