ప్రైమర్ డిజైన్ ఆధారంగా (99% సమస్యలు పరిష్కరించబడతాయి)

1. ప్రైమర్ పొడవు: పాఠ్యపుస్తకానికి 15-30bp అవసరం, సాధారణంగా 20bp.నిర్దిష్టతను నిర్ధారించడానికి వాస్తవ పరిస్థితి 18-24bpగా ఉండటం మంచిది, అయితే ఎక్కువ కాలం మెరుగ్గా, చాలా పొడవుగా ఉండే ప్రైమర్ కూడా నిర్దిష్టతను తగ్గిస్తుంది మరియు దిగుబడిని తగ్గిస్తుంది.

2. ప్రైమర్ యాంప్లిఫికేషన్ span: 200-500bp సముచితం, మరియు నిర్దిష్ట పరిస్థితులలో భాగాన్ని 10kbకి విస్తరించవచ్చు.

3. ప్రైమర్ బేస్: G+C యొక్క కంటెంట్ 40-60% ఉండాలి, చాలా తక్కువ G+C యాంప్లిఫికేషన్ ప్రభావం మంచిది కాదు, చాలా G+C అనేది నాన్-స్పెసిఫిక్ బ్యాండ్‌లుగా కనిపించడం సులభం.ATGC ఉత్తమంగా యాదృచ్ఛికంగా పంపిణీ చేయబడుతుంది, 5 కంటే ఎక్కువ ప్యూరిన్ లేదా పిరిమిడిన్ న్యూక్లియోటైడ్‌ల సమూహాలను నివారిస్తుంది.స్థిరత్వాన్ని పెంచడానికి 5′ ముగింపు మరియు ఇంటర్మీడియట్ సీక్వెన్స్‌లకు మల్టీ-జిసి, 3′ చివర రిచ్ జిసిని నివారించండి, చివరి 3 బేస్‌లకు జిసి లేదు లేదా చివరి 5 బేస్‌లలో 3కి జిసి లేదు.

4. ప్రైమర్‌లలో సెకండరీ స్ట్రక్చర్‌ను నివారించండి మరియు రెండు ప్రైమర్‌ల మధ్య కాంప్లిమెంటేషన్‌ను నివారించండి, ప్రత్యేకించి 3 'ఎండ్‌లో కాంప్లిమెంటేషన్, లేకపోతే ప్రైమర్ డైమర్ ఏర్పడుతుంది మరియు నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫైడ్ బ్యాండ్‌లు ఉత్పత్తి చేయబడతాయి.

5. జత చేయని టెర్మినల్ బేస్‌ల కారణంగా PCR వైఫల్యాన్ని నివారించడానికి ప్రైమర్‌ల 3 'చివరలో ఉన్న బేస్‌లు, ముఖ్యంగా చివరి మరియు చివరి బేస్‌లు ఖచ్చితంగా జత చేయబడాలి.

6. ప్రైమర్‌లు తగిన క్లీవేజ్ సైట్‌లను కలిగి ఉంటాయి లేదా వాటిని జోడించవచ్చు మరియు విస్తరించిన లక్ష్య శ్రేణికి తగిన క్లీవేజ్ సైట్‌లు ఉండాలి, ఇది క్లీవేజ్ విశ్లేషణ లేదా మాలిక్యులర్ క్లోనింగ్‌కు చాలా ప్రయోజనకరంగా ఉంటుంది.

7. ప్రైమర్‌ల ప్రత్యేకత: న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ సీక్వెన్స్ డేటాబేస్‌లోని ఇతర సీక్వెన్స్‌లతో ప్రైమర్‌లకు స్పష్టమైన హోమోలజీ ఉండకూడదు.

8. సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించడం నేర్చుకోండి: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (ఈ ఆన్‌లైన్ డిజైన్ ఉత్తమంగా పనిచేస్తుంది).

పై కంటెంట్ కనీసం 99% ప్రైమర్ డిజైన్ సమస్యలను పరిష్కరించగలదు.

ప్రైమర్ డిజైన్ వివరాలను నియంత్రించండి

1. ప్రైమర్ పొడవు

సాధారణ ప్రైమర్ పొడవు 18~30 బేస్‌లు.సాధారణంగా, ప్రైమర్ యొక్క ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను నిర్ణయించే అతి ముఖ్యమైన అంశం ప్రైమర్ యొక్క పొడవు.ప్రైమర్ యొక్క ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత సాధారణంగా ఎంపిక చేయబడుతుంది (Tm విలువ -5℃), మరియు కొన్ని నేరుగా Tm విలువను ఉపయోగిస్తాయి.ప్రైమర్‌ల యొక్క ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను సుమారుగా లెక్కించడానికి క్రింది సూత్రాలను ఉపయోగించవచ్చు.

ప్రైమర్ పొడవు 20bp కంటే తక్కువగా ఉన్నప్పుడు: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃

ప్రైమర్ పొడవు 20bp కంటే ఎక్కువగా ఉన్నప్పుడు: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/పొడవు-5℃

అదనంగా, అనేక సాఫ్ట్‌వేర్‌లను ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను లెక్కించడానికి కూడా ఉపయోగించవచ్చు, గణన సూత్రం భిన్నంగా ఉంటుంది, కాబట్టి కొన్నిసార్లు లెక్కించిన విలువలో చిన్న గ్యాప్ ఉండవచ్చు.PCR ప్రతిచర్యలను ఆప్టిమైజ్ చేయడానికి, 54℃ కంటే తక్కువ ఉష్ణోగ్రతలను నిర్ధారించే అతి తక్కువ ప్రైమర్‌లు ఉత్తమ సామర్థ్యం మరియు నిర్దిష్టత కోసం ఉపయోగించబడతాయి.

మొత్తంమీద, ప్రతి అదనపు న్యూక్లియోటైడ్‌కు ప్రైమర్ విశిష్టత నాలుగు రెట్లు పెరుగుతుంది, తద్వారా చాలా అప్లికేషన్‌లకు కనీస ప్రైమర్ పొడవు 18 న్యూక్లియోటైడ్‌లు.ప్రైమర్ పొడవు యొక్క ఎగువ పరిమితి చాలా ముఖ్యమైనది కాదు, ప్రధానంగా ప్రతిచర్య సామర్థ్యానికి సంబంధించినది.ఎంట్రోపీ కారణంగా, ప్రైమర్ పొడవుగా ఉంటే, DNA పాలీమరేస్‌ను బంధించడానికి స్థిరమైన డబుల్ స్ట్రాండెడ్ టెంప్లేట్‌ను రూపొందించడానికి లక్ష్య DNAతో బంధించడానికి ఇది తక్కువ రేటును కలిగి ఉంటుంది.

ప్రైమర్‌లను రూపొందించడానికి సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగిస్తున్నప్పుడు, ప్రైమర్‌ల పొడవును TM విలువ ద్వారా నిర్ణయించవచ్చు, ముఖ్యంగా ఫ్లోరోసెన్స్ క్వాంటిటేటివ్ PCR యొక్క ప్రైమర్‌ల కోసం, TM=60℃ లేదా నియంత్రించాలి.

2.GC కంటెంట్

సాధారణంగా, ప్రైమర్ సీక్వెన్స్‌లలో G+C యొక్క కంటెంట్ 40%~60%, మరియు GC కంటెంట్ మరియు ఒక జత ప్రైమర్‌ల Tm విలువను సమన్వయం చేయాలి.ప్రైమర్ తీవ్రమైన GC లేదా AT ధోరణిని కలిగి ఉన్నట్లయితే, ప్రైమర్ యొక్క 5 'ఎండ్‌కి తగిన మొత్తంలో A, T లేదా G మరియు C టైల్‌ను జోడించవచ్చు.

3. ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత

చైన్ ఉష్ణోగ్రత కంటే ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత 5℃ తక్కువగా ఉండాలి.ప్రైమర్ బేస్‌ల సంఖ్య తక్కువగా ఉంటే, ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను తగిన విధంగా పెంచవచ్చు, ఇది PCR యొక్క ప్రత్యేకతను పెంచుతుంది.స్థావరాల సంఖ్య పెద్దగా ఉంటే, ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను తగిన విధంగా తగ్గించవచ్చు.4℃ ~ 6℃ ప్రైమర్‌ల జత మధ్య ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత వ్యత్యాసం PCR దిగుబడిని ప్రభావితం చేయదు, అయితే ఆదర్శంగా ఒక జత ప్రైమర్‌ల యొక్క ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత ఒకే విధంగా ఉంటుంది, ఇది 55℃ ~ 75℃ మధ్య మారవచ్చు.

4. యాంప్లిఫికేషన్ టెంప్లేట్ యొక్క ద్వితీయ నిర్మాణ ప్రాంతాన్ని నివారించండి

విస్తరించిన భాగాన్ని ఎంచుకునేటప్పుడు టెంప్లేట్ యొక్క ద్వితీయ నిర్మాణ ప్రాంతాన్ని నివారించడం ఉత్తమం.లక్ష్య భాగం యొక్క స్థిరమైన ద్వితీయ నిర్మాణాన్ని సంబంధిత కంప్యూటర్ సాఫ్ట్‌వేర్ ద్వారా అంచనా వేయవచ్చు మరియు అంచనా వేయవచ్చు, ఇది టెంప్లేట్ ఎంపికకు సహాయపడుతుంది.విస్తరించాల్సిన ప్రాంతం యొక్క ఉచిత శక్తి (△G) 58.6lkJ/mol కంటే తక్కువగా ఉన్నప్పుడు విస్తరణ తరచుగా విఫలమవుతుందని ప్రయోగాత్మక ఫలితాలు చూపిస్తున్నాయి.

5. లక్ష్యం DNAతో అసమతుల్యత

విస్తరించిన లక్ష్య DNA శ్రేణి పెద్దగా ఉన్నప్పుడు, ఒక ప్రైమర్ లక్ష్య DNA యొక్క బహుళ భాగాలకు కట్టుబడి ఉండవచ్చు, ఫలితంగా బహుళ బ్యాండ్‌లు ఫలితంగా కనిపిస్తాయి.ఈసారి BLAST సాఫ్ట్‌వేర్ టెస్టింగ్, వెబ్‌సైట్‌ను ఉపయోగించడం అవసరం:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.రెండు సీక్వెన్స్‌లను సమలేఖనం చేయి ఎంచుకోండి (bl2seq).

జోన్ 1కి ప్రైమర్ సీక్వెన్స్‌లను మరియు జోన్ 2కి టార్గెట్ DNA సీక్వెన్స్‌లను అతికించడం పరస్పరం మార్చుకోగలిగినది, మరియు BLAST కాంప్లిమెంటరీ, యాంటిసెన్స్ మరియు ఇతర అవకాశాలను గణిస్తుంది, కాబట్టి వినియోగదారులు రెండు చైన్‌లు సెన్స్ చెయిన్‌లుగా ఉన్నాయో లేదో గమనించాల్సిన అవసరం లేదు.డేటాబేస్‌లో సీక్వెన్స్ యొక్క GI నంబర్ మీకు తెలిస్తే మీరు GI నంబర్‌ను కూడా నమోదు చేయవచ్చు, కాబట్టి మీరు సీక్వెన్స్‌లోని పెద్ద భాగాన్ని అతికించాల్సిన అవసరం లేదు.చివరగా, లక్ష్య DNAలో ప్రైమర్‌లో బహుళ హోమోలాగస్ సైట్‌లు ఉన్నాయో లేదో చూడటానికి 3 వద్ద సమలేఖనం చేయి క్లిక్ చేయండి.

6. ప్రైమర్ టెర్మినల్

ప్రైమర్ యొక్క 3 'ముగింపు పొడిగింపు ప్రారంభమవుతుంది, కాబట్టి అసమానతలను అక్కడ ప్రారంభించకుండా నిరోధించడం చాలా ముఖ్యం.3 'ముగింపు వరుసగా 3 G లేదా C కంటే ఎక్కువ ఉండకూడదు, ఎందుకంటే ఇది G+C ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ సీక్వెన్స్ రీజియన్‌లో ప్రైమర్ పొరపాటుగా ట్రిగ్గర్ చేయబడటానికి కారణమవుతుంది.ప్రత్యేక PCR (AS-PCR) ప్రతిచర్యలలో మినహా 3 'ముగింపు ఏ ద్వితీయ నిర్మాణాన్ని ఏర్పరచదు, ప్రైమర్ యొక్క 3′ ముగింపు సరిపోలలేదు.ఉదాహరణకు, ఎన్‌కోడింగ్ ప్రాంతం విస్తరించబడితే, కోడాన్ యొక్క మూడవ స్థానం వద్ద ప్రైమర్ యొక్క 3 'ముగింపును ముగించకూడదు, ఎందుకంటే కోడాన్ యొక్క మూడవ స్థానం క్షీణించే అవకాశం ఉంది, ఇది విస్తరణ యొక్క నిర్దిష్టత మరియు సామర్థ్యాన్ని ప్రభావితం చేస్తుంది.అనుబంధ ప్రైమర్‌లను ఉపయోగిస్తున్నప్పుడు, కోడాన్ వినియోగ పట్టికను చూడండి, జీవ ప్రాధాన్యతపై శ్రద్ధ వహించండి, 3′ చివరలో అనుబంధ ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించవద్దు మరియు ప్రైమర్‌ల (1uM-3uM) అధిక సాంద్రతను ఉపయోగించండి.

7. ప్రైమర్ల ద్వితీయ నిర్మాణం

ప్రైమర్‌లు వాటికవే కాంప్లిమెంటరీ సీక్వెన్స్‌లను కలిగి ఉండకూడదు, లేకుంటే ప్రైమర్‌లు స్వయంగా హెయిర్‌పిన్ నిర్మాణాలుగా ముడుచుకుంటాయి మరియు ఈ ద్వితీయ నిర్మాణం స్టెరిక్ అడ్డంకి కారణంగా ప్రైమర్‌లు మరియు టెంప్లేట్‌ల బైండింగ్‌ను ప్రభావితం చేస్తుంది.కృత్రిమ తీర్పును ఉపయోగించినట్లయితే, ప్రైమర్‌ల యొక్క నిరంతర పరిపూరకరమైన స్థావరాలు 3bp కంటే ఎక్కువగా ఉండకూడదు.రెండు ప్రైమర్‌ల మధ్య కాంప్లిమెంటరీ ఉండకూడదు, ముఖ్యంగా ప్రైమర్ డైమర్‌లు ఏర్పడకుండా నిరోధించడానికి 3 'ఎండ్ యొక్క కాంప్లిమెంటరీ ఓవర్‌లాప్‌ను నివారించాలి.సాధారణంగా, ఒక జత ప్రైమర్‌ల మధ్య వరుసగా 4 కంటే ఎక్కువ బేస్‌లు హోమోలజీ లేదా కాంప్లిమెంటరిటీ ఉండకూడదు.

8. మార్కర్లను లేదా లోకీని జోడించండి

5 'ఎండ్ యాంప్లిఫికేషన్ స్పెసిసిటీపై తక్కువ ప్రభావం చూపుతుంది మరియు అందువల్ల యాంప్లిఫికేషన్ స్పెసిసిటీని ప్రభావితం చేయకుండా సవరించవచ్చు.ప్రైమర్ 5 'ఎండ్ యొక్క మార్పు చేర్చబడింది: ఎంజైమ్ పరిమితి సైట్‌ను జోడించడం;లేబుల్ చేయబడిన బయోటిన్, ఫ్లోరోసెన్స్, డిగోక్సిన్, Eu3+, మొదలైనవి. ప్రొటీన్ బైండింగ్ DNA సీక్వెన్స్‌లను పరిచయం చేయండి;మ్యుటేషన్ సైట్‌లను పరిచయం చేయడం, మ్యుటేషన్ సీక్వెన్స్‌లను ఇన్‌సర్ట్ చేయడం మరియు మిస్ చేయడం మరియు ప్రమోటర్ సీక్వెన్స్‌లను పరిచయం చేయడం మొదలైనవి. అదనపు బేస్‌లు యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని ఎక్కువ లేదా తక్కువ ప్రభావితం చేస్తాయి మరియు ప్రైమర్ డైమర్ ఏర్పడే అవకాశాన్ని పెంచుతాయి, అయితే తదుపరి దశ కోసం కొన్ని రాయితీలు తప్పక చేయాలి.పరిమితి సైట్‌లు మరియు ప్రమోటర్ సీక్వెన్స్‌లు వంటి లక్ష్య శ్రేణిలో లేని అదనపు సీక్వెన్స్‌లు నిర్దిష్టతను ప్రభావితం చేయకుండా ప్రైమర్ యొక్క 5′ ముగింపుకు జోడించబడతాయి.ఈ సీక్వెన్సులు ప్రైమర్ Tm విలువల గణనలో చేర్చబడలేదు, కానీ పరిపూరకత మరియు అంతర్గత ద్వితీయ నిర్మాణం కోసం పరీక్షించబడాలి.

9. సబ్‌క్లోన్స్

చాలా వరకు, PCR అనేది ప్రాథమిక క్లోనింగ్ మాత్రమే, ఆపై మేము లక్ష్య భాగాన్ని వివిధ వెక్టర్‌లుగా సబ్‌క్లోన్ చేయాలి, కాబట్టి మేము PCR దశలో తదుపరి ఆపరేషన్ కోసం అదనపు బేస్‌లను రూపొందించాలి.

సబ్‌క్లోనింగ్ కోసం రూపొందించబడిన కొన్ని సీక్వెన్సులు క్రింద సంగ్రహించబడ్డాయి.
పరిమితి ఎండోన్యూక్లీస్ పరిమితి సైట్ జోడించబడింది

ఎంజైమ్ పరిమితి సైట్‌లను జోడించడం అనేది PCR ఉత్పత్తులను సబ్‌క్లోనింగ్ చేయడానికి సాధారణంగా ఉపయోగించే పద్ధతి.సాధారణంగా, క్లీవేజ్ సైట్ ఆరు బేస్‌లు, క్లీవేజ్ సైట్ యొక్క 5 'ఎండ్‌కు అదనంగా 2 ~ 3 ప్రొటెక్టివ్ బేస్‌లను జోడించాలి.అయితే, వివిధ ఎంజైమ్‌లకు అవసరమైన రక్షిత స్థావరాల సంఖ్య భిన్నంగా ఉంటుంది.ఉదాహరణకు, SalⅠకి రక్షిత బేస్ అవసరం లేదు, EcoRⅤకి 1 ప్రొటెక్టివ్ బేస్ అవసరం, NotⅠకి 2 ప్రొటెక్టివ్ బేస్‌లు అవసరం మరియు హింద్ Ⅲకి 3 ప్రొటెక్టివ్ బేస్‌లు అవసరం.

LIC తోకను జోడిస్తుంది

LIC యొక్క పూర్తి పేరు లిగేషన్-ఇండిపెండెంట్ క్లోనింగ్, ఇది pET వెక్టర్‌లో దాని భాగానికి ప్రత్యేకంగా Navogen కనిపెట్టిన క్లోనింగ్ పద్ధతి.LIC పద్ధతి ద్వారా తయారు చేయబడిన pET క్యారియర్ నాన్-కాంప్లిమెంటరీ 12-15 బేస్ సింగిల్ స్ట్రాండ్ స్టిక్కీ ఎండ్‌లను కలిగి ఉంది, ఇది టార్గెట్ ఇన్సర్ట్ ఫ్రాగ్‌మెంట్‌పై సంబంధిత స్టిక్కీ ఎండ్‌లను పూర్తి చేస్తుంది.యాంప్లిఫికేషన్ ప్రయోజనాల కోసం, చొప్పించిన భాగం యొక్క ప్రైమర్ 5′ సీక్వెన్స్ LIC వెక్టర్‌ను పూర్తి చేయాలి.T4 DNA పాలిమరేస్ యొక్క 3′→5′ ఎక్స్‌ట్రానెక్ట్ యాక్టివిటీ తక్కువ సమయం తర్వాత చొప్పించిన భాగంపై ఒకే స్ట్రాండ్ స్టిక్కీ ఎండ్‌ను ఏర్పరుస్తుంది.తయారు చేయబడిన ఇన్సర్ట్ ఫ్రాగ్మెంట్ మరియు వెక్టర్ యొక్క పరస్పర ఎనియలింగ్ నుండి మాత్రమే ఉత్పత్తి ఏర్పడుతుంది కాబట్టి, ఈ పద్ధతి చాలా వేగంగా మరియు సమర్థవంతంగా ఉంటుంది మరియు ఇది క్లోనింగ్‌కు దర్శకత్వం వహించబడుతుంది.
దర్శకత్వం వహించిన TA క్లోన్ యాడ్ టెయిల్
TA క్లోనింగ్ శకలాన్ని వెక్టార్‌గా లక్ష్యంగా చేసుకోలేకపోయింది, కాబట్టి తరువాత ఇన్విట్రోజెన్ క్లోనింగ్‌ను లక్ష్యంగా చేసుకోగల వెక్టర్‌ను ప్రవేశపెట్టింది, ఇందులో ఒక చివర నాలుగు ప్రముఖ బేస్ GTGGS ఉంది.అందువల్ల, PCR ప్రైమర్‌ల రూపకల్పనలో, కాంప్లిమెంటరీ సీక్వెన్స్‌లను తదనుగుణంగా జోడించాలి, తద్వారా శకలాలు "ఓరియెంటెడ్" కావచ్చు.

మీకు సమయం తక్కువగా ఉన్నట్లయితే, మీరు ప్రత్యక్ష సంశ్లేషణను ప్రయత్నించవచ్చు, జన్యువును వెక్టర్‌తో కలపడం ద్వారా దీనిని మేము ET జన్యు సంశ్లేషణ అని పిలుస్తాము.

D. ఇన్-ఫ్యూజన్ క్లోనింగ్ పద్ధతి

లిగేజ్ అవసరం లేదు, సుదీర్ఘ ప్రతిచర్య అవసరం లేదు.ప్రైమర్‌ల రూపకల్పనలో లీనియరైజ్డ్ వెక్టార్ యొక్క రెండు చివర్లలో ఒక క్రమాన్ని ప్రవేశపెట్టినంత కాలం, PCR ఉత్పత్తి మరియు లీనియరైజ్డ్ వెక్టార్‌లు BSA కలిగిన ఇన్-ఫ్యూజన్ ఎంజైమ్ ద్రావణంలో జోడించబడతాయి మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద అరగంట పాటు ఉంచబడతాయి, పరివర్తన చేయవచ్చు.పెద్ద వాల్యూమ్ మార్పిడికి ఈ పద్ధతి ప్రత్యేకంగా సరిపోతుంది.

10. ప్రైమర్‌ను విలీనం చేయండి

కొన్నిసార్లు, ప్రైమర్ డిజైన్ గురించి పరిమిత శ్రేణి సమాచారం మాత్రమే తెలుసు.ఉదాహరణకు, అమినో యాసిడ్ సీక్వెన్స్ మాత్రమే తెలిస్తే, మెర్జింగ్ ప్రైమర్‌ను రూపొందించవచ్చు.విలీన ప్రైమర్ అనేది ఒకే అమైనో ఆమ్లాన్ని ఎన్‌కోడ్ చేసే అన్ని విభిన్న బేస్ అవకాశాలను సూచించే విభిన్న శ్రేణుల మిశ్రమం.నిర్దిష్టతను పెంచడానికి, వివిధ జీవుల యొక్క ఆధార వినియోగ ప్రాధాన్యతల ప్రకారం అనుబంధాన్ని తగ్గించడానికి మీరు కోడాన్ వినియోగ పట్టికను చూడవచ్చు.ప్రైమర్ యొక్క ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను తగ్గించడానికి హైపోక్సాంథైన్‌ని అన్ని బేస్‌లతో జత చేయవచ్చు.ప్రైమర్ యొక్క 3′ చివరన అనుబంధిత బేస్‌లను ఉపయోగించవద్దు ఎందుకంటే తప్పు సైట్‌లో PCRని ప్రారంభించడానికి 3′ చివరలో చివరి 3 బేస్‌ల ఎనియలింగ్ సరిపోతుంది.అధిక ప్రైమర్ సాంద్రతలు (1μM నుండి 3μM) ఉపయోగించబడతాయి ఎందుకంటే అనేక అనుబంధ మిశ్రమాలలో ప్రైమర్‌లు లక్ష్య టెంప్లేట్‌కు నిర్దిష్టంగా లేవు.

PCR ముడి పదార్థాలునియంత్రణ

1. ప్రైమర్ పరిమాణం

ప్రతి ప్రైమర్ యొక్క గాఢత 0.1 ~ 1umol లేదా 10 ~ 100pmol.ప్రైమర్ యొక్క అత్యల్ప మొత్తంతో అవసరమైన ఫలితాన్ని ఉత్పత్తి చేయడం మంచిది.ప్రైమర్ యొక్క అధిక సాంద్రత అసమతుల్యత మరియు నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్‌కు కారణమవుతుంది మరియు ప్రైమర్‌ల మధ్య డైమర్‌లు ఏర్పడే అవకాశాన్ని పెంచుతుంది.

2. ప్రైమర్ ఏకాగ్రత

ప్రైమర్ల ఏకాగ్రత నిర్దిష్టతను ప్రభావితం చేస్తుంది.సరైన ప్రైమర్ ఏకాగ్రత సాధారణంగా 0.1 మరియు 0.5μM మధ్య ఉంటుంది.అధిక ప్రైమర్ సాంద్రతలు నిర్ధిష్ట ఉత్పత్తుల విస్తరణకు దారితీస్తాయి.

3. ప్రైమర్ యొక్క ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత

ప్రైమర్ల కోసం మరొక ముఖ్యమైన పరామితి ద్రవీభవన ఉష్ణోగ్రత (Tm).50% ప్రైమర్‌లు మరియు కాంప్లిమెంటరీ సీక్వెన్స్‌లు డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA అణువులుగా సూచించబడినప్పుడు ఇది ఉష్ణోగ్రత.PCR ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను సెట్ చేయడానికి Tm అవసరం.ఆదర్శవంతంగా, ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత లక్ష్య శ్రేణితో ప్రైమర్‌ల ప్రభావవంతమైన ఎనియలింగ్‌ను నిర్ధారించడానికి తగినంత తక్కువగా ఉంటుంది, కానీ నిర్ధిష్ట బైండింగ్‌ను తగ్గించేంత ఎక్కువగా ఉంటుంది.55℃ నుండి 70℃ వరకు సహేతుకమైన ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత.ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత సాధారణంగా ప్రైమర్ Tm కంటే 5℃ తక్కువగా సెట్ చేయబడుతుంది.

Tm సెట్ చేయడానికి అనేక సూత్రాలు ఉన్నాయి, ఇవి ఉపయోగించిన సూత్రం మరియు ప్రైమర్‌ల క్రమాన్ని బట్టి చాలా తేడా ఉంటుంది.చాలా సూత్రాలు అంచనా వేసిన Tm విలువను అందిస్తాయి కాబట్టి, అన్ని ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతలు ఒక ప్రారంభ స్థానం మాత్రమే.ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను క్రమంగా పెంచే అనేక ప్రతిచర్యలను విశ్లేషించడం ద్వారా నిర్దిష్టతను మెరుగుపరచవచ్చు.అంచనా వేయబడిన Tm-5℃ కంటే దిగువన ప్రారంభించండి మరియు క్రమంగా ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను 2℃ పెరుగుదలలో పెంచండి.అధిక ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత ప్రైమర్ డైమర్లు మరియు నాన్-స్పెసిఫిక్ ప్రొడక్ట్స్ ఏర్పడటాన్ని తగ్గిస్తుంది.ఉత్తమ ఫలితాల కోసం, రెండు ప్రైమర్‌లు సుమారుగా Tm విలువలను కలిగి ఉండాలి.ప్రైమర్ జతల యొక్క Tm వ్యత్యాసం 5℃ కంటే ఎక్కువగా ఉంటే, ప్రైమర్‌లు చక్రంలో తక్కువ ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతని ఉపయోగించడం ద్వారా గణనీయమైన తప్పుడు ప్రారంభాన్ని చూపుతాయి.రెండు ప్రైమర్‌లు Tm భిన్నంగా ఉంటే, ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను అత్యల్ప Tm కంటే 5℃ తక్కువగా సెట్ చేయండి.ప్రత్యామ్నాయంగా, నిర్దిష్టతను పెంచడానికి, అధిక Tm కోసం రూపొందించబడిన ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతల వద్ద ముందుగా ఐదు చక్రాలను ప్రదర్శించవచ్చు, తరువాత తక్కువ Tm కోసం రూపొందించబడిన ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతల వద్ద మిగిలిన చక్రాలను చేయవచ్చు.ఇది కఠినమైన పరిస్థితుల్లో గమ్యం టెంప్లేట్ యొక్క పాక్షిక కాపీని పొందడానికి అనుమతిస్తుంది.

4. ప్రైమర్ స్వచ్ఛత మరియు స్థిరత్వం

కస్టమ్ ప్రైమర్‌ల యొక్క ప్రామాణిక స్వచ్ఛత చాలా PCR అప్లికేషన్‌లకు సరిపోతుంది.డీసల్టింగ్ ద్వారా బెంజాయిల్ మరియు ఐసోబుటైల్ సమూహాల తొలగింపు తక్కువగా ఉంటుంది మరియు అందువల్ల PCRతో జోక్యం చేసుకోదు.సంశ్లేషణ ప్రక్రియలో ఏదైనా పూర్తి-నిడివి లేని సీక్వెన్స్‌లను తొలగించడానికి కొన్ని అప్లికేషన్‌లకు శుద్ధి అవసరం.DNA సంశ్లేషణ కెమిస్ట్రీ యొక్క సామర్థ్యం 100% కానందున ఈ కత్తిరించబడిన సీక్వెన్సులు సంభవిస్తాయి.3′ నుండి 5′ వరకు DNA చేయడానికి ప్రతి బేస్ జోడించబడినందున ఇది పునరావృత రసాయన ప్రతిచర్యలను ఉపయోగించే వృత్తాకార ప్రక్రియ.మీరు ఏ చక్రంలోనైనా విఫలం కావచ్చు.పొడవైన ప్రైమర్‌లు, ముఖ్యంగా 50 బేస్‌ల కంటే ఎక్కువ, కత్తిరించబడిన సీక్వెన్స్‌ల యొక్క అధిక నిష్పత్తిని కలిగి ఉంటాయి మరియు శుద్ధి అవసరం కావచ్చు.

ప్రైమర్ల దిగుబడి సింథటిక్ కెమిస్ట్రీ మరియు శుద్దీకరణ పద్ధతి యొక్క సామర్థ్యం ద్వారా ప్రభావితమవుతుంది.సైటోలజీ మరియు షెంగాంగ్ వంటి బయోఫార్మాస్యూటికల్ కంపెనీలు ఒలిగోన్యూక్లియోసైడ్ యొక్క మొత్తం అవుట్‌పుట్‌ను నిర్ధారించడానికి కనీస OD యూనిట్‌ను ఉపయోగిస్తాయి.కస్టమ్ ప్రైమర్‌లు పొడి పొడి రూపంలో రవాణా చేయబడతాయి.TEలో ప్రైమర్‌లను మళ్లీ విడదీయడం ఉత్తమం, తద్వారా తుది ఏకాగ్రత 100μM ఉంటుంది.డీయోనైజ్డ్ నీటి కంటే TE మంచిది ఎందుకంటే నీటి pH తరచుగా ఆమ్లంగా ఉంటుంది మరియు ఒలిగోన్యూక్లియోసైడ్స్ యొక్క జలవిశ్లేషణకు కారణమవుతుంది.

ప్రైమర్ల స్థిరత్వం నిల్వ పరిస్థితులపై ఆధారపడి ఉంటుంది.పొడి పొడి మరియు కరిగిన ప్రైమర్‌లను -20℃ వద్ద నిల్వ చేయాలి.TEలో 10μM కంటే ఎక్కువ సాంద్రతలో కరిగిన ప్రైమర్‌లను -20℃ వద్ద 6 నెలల పాటు స్థిరంగా నిల్వ చేయవచ్చు, అయితే గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద (15℃ నుండి 30℃ వరకు) 1 వారం కంటే తక్కువ వరకు మాత్రమే నిల్వ చేయవచ్చు.డ్రై పౌడర్ ప్రైమర్‌లను కనీసం 1 సంవత్సరం వరకు -20 C వద్ద మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద (15 C నుండి 30 C వరకు) 2 నెలల వరకు నిల్వ చేయవచ్చు.

5. ఎంజైములు మరియు వాటి సాంద్రతలు

ప్రస్తుతం, Taq DNA పాలిమరేస్ ప్రాథమికంగా కోలిఫాం బ్యాక్టీరియా ద్వారా సంశ్లేషణ చేయబడిన జన్యు ఇంజనీరింగ్ ఎంజైమ్.ఒక సాధారణ PCR ప్రతిచర్యను ఉత్ప్రేరకపరచడానికి అవసరమైన ఎంజైమ్ మొత్తం సుమారు 2.5U (100ul యొక్క మొత్తం ప్రతిచర్య వాల్యూమ్‌ను సూచిస్తుంది).ఏకాగ్రత చాలా ఎక్కువగా ఉంటే, అది నిర్దిష్ట-కాని విస్తరణకు దారి తీస్తుంది;ఏకాగ్రత చాలా తక్కువగా ఉంటే, సింథటిక్ ఉత్పత్తి మొత్తం తగ్గించబడుతుంది.

6. dNTP నాణ్యత మరియు ఏకాగ్రత

dNTP యొక్క నాణ్యత PCR యాంప్లిఫికేషన్ యొక్క ఏకాగ్రత మరియు సామర్థ్యానికి దగ్గరి సంబంధం కలిగి ఉంటుంది.dNTP పౌడర్ కణికగా ఉంటుంది మరియు అది సరిగ్గా నిల్వ చేయబడకపోతే దాని వైవిధ్యం దాని జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను కోల్పోతుంది.dNTP ద్రావణం ఆమ్లంగా ఉంటుంది మరియు 1M NaOH లేదా 1M Tris.HCL బఫర్ సొల్యూషన్‌తో దాని PHని 7.0 ~ 7.5కి సర్దుబాటు చేయడానికి, తక్కువ మొత్తంలో ఉప-ప్యాకేజింగ్, -20℃ వద్ద స్తంభింపచేసిన నిల్వతో అధిక సాంద్రతలో ఉపయోగించాలి.బహుళ ఫ్రీజ్-థావింగ్ dNTPని క్షీణింపజేస్తుంది.PCR ప్రతిచర్యలో, dNTP 50 ~ 200umol/L ఉండాలి.ముఖ్యంగా, నాలుగు DNTPS యొక్క ఏకాగ్రత సమానంగా ఉండాలి (సమాన మోల్ తయారీ) దృష్టిని చెల్లించాలి.వాటిలో ఏదైనా ఒకదాని యొక్క ఏకాగ్రత ఇతర వాటి కంటే భిన్నంగా ఉంటే (ఎక్కువ లేదా తక్కువ), అసమతుల్యత ఏర్పడుతుంది.చాలా తక్కువ గాఢత PCR ఉత్పత్తుల దిగుబడిని తగ్గిస్తుంది.dNTP Mg2+తో కలపవచ్చు మరియు ఉచిత Mg2+ సాంద్రతను తగ్గిస్తుంది.

7. మూస (లక్ష్య జన్యువు) న్యూక్లియిక్ ఆమ్లం

న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ టెంప్లేట్ మొత్తం మరియు శుద్ధి డిగ్రీ PCR యొక్క విజయం లేదా వైఫల్యానికి కీలకమైన లింక్‌లలో ఒకటి.సాంప్రదాయ DNA శుద్దీకరణ పద్ధతులు సాధారణంగా SDS మరియు ప్రోటీజ్ K లను జీర్ణం చేయడానికి మరియు నమూనాలను పారవేసేందుకు ఉపయోగిస్తాయి.SDS యొక్క ప్రధాన విధులు: కణ త్వచంపై లిపిడ్‌లు మరియు ప్రోటీన్‌లను కరిగించడం, తద్వారా మెమ్బ్రేన్ ప్రోటీన్‌లను కరిగించడం ద్వారా కణ త్వచాన్ని నాశనం చేయడం మరియు సెల్‌లోని న్యూక్లియర్ ప్రోటీన్‌లను విడదీయడం, SDS కూడా ప్రోటీన్‌లతో కలపవచ్చు మరియు అవక్షేపించవచ్చు;ప్రోటీజ్ K ప్రోటీన్లను హైడ్రోలైజ్ చేసి జీర్ణం చేయగలదు, ముఖ్యంగా DNAతో బంధించబడిన హిస్టోన్‌లు, ఆపై ప్రొటీన్లు మరియు ఇతర కణ భాగాలను సంగ్రహించడానికి ఆర్గానిక్ సాల్వెంట్ ఫినాల్ మరియు క్లోరోఫామ్‌ను ఉపయోగిస్తాయి మరియు న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాన్ని అవక్షేపించడానికి ఇథనాల్ లేదా ఐసోప్రొపైల్ ఆల్కహాల్‌ను ఉపయోగిస్తాయి.సేకరించిన న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ PCR ప్రతిచర్యలకు టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించవచ్చు.సాధారణ క్లినికల్ డిటెక్షన్ నమూనాల కోసం, కణాలను కరిగించడానికి, లైసేట్ పాథోజెన్‌లకు, క్రోమోజోమ్‌ల నుండి ఉచిత లక్ష్య జన్యువులకు ప్రోటీన్‌లను జీర్ణం చేయడానికి మరియు తొలగించడానికి త్వరిత మరియు సరళమైన పద్ధతిని ఉపయోగించవచ్చు మరియు నేరుగా PCR యాంప్లిఫికేషన్ కోసం ఉపయోగించవచ్చు.RNA టెంప్లేట్ వెలికితీత సాధారణంగా గ్వానిడైన్ ఐసోథియోసైనేట్ లేదా ప్రోటీజ్ K పద్ధతిని ఉపయోగిస్తుంది, RNaseని RNA దిగజార్చకుండా నిరోధించడానికి.

8.Mg2+ గాఢత

PCR యాంప్లిఫికేషన్ యొక్క నిర్దిష్టత మరియు దిగుబడిపై Mg2+ గణనీయమైన ప్రభావాన్ని చూపుతుంది.సాధారణ PCR ప్రతిచర్యలో, వివిధ dNTP యొక్క ఏకాగ్రత 200umol/L అయినప్పుడు, Mg2+ యొక్క తగిన సాంద్రత 1.5 ~ 2.0mmol/L.Mg2+ ఏకాగ్రత చాలా ఎక్కువగా ఉంది, ప్రతిచర్య విశిష్టత తగ్గుతుంది, నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ జరుగుతుంది, చాలా తక్కువ ఏకాగ్రత Taq DNA పాలిమరేస్ యొక్క కార్యాచరణను తగ్గిస్తుంది, ఫలితంగా ప్రతిచర్య ఉత్పత్తులు తగ్గుతాయి.

మెగ్నీషియం అయాన్లు DNA పాలిమరేస్ చర్య వంటి PCR యొక్క అనేక అంశాలను ప్రభావితం చేస్తాయి, ఇది దిగుబడిని ప్రభావితం చేస్తుంది;మరొక ఉదాహరణ ప్రైమర్ ఎనియలింగ్, ఇది నిర్దిష్టతను ప్రభావితం చేస్తుంది.dNTP మరియు టెంప్లేట్ మెగ్నీషియం అయాన్‌తో బంధిస్తాయి, ఎంజైమ్ కార్యకలాపాలకు అవసరమైన ఉచిత మెగ్నీషియం అయాన్ మొత్తాన్ని తగ్గిస్తుంది.వివిధ ప్రైమర్ జతలు మరియు టెంప్లేట్‌లకు సరైన మెగ్నీషియం అయాన్ గాఢత మారుతూ ఉంటుంది, అయితే 200μM dNTPతో ఒక సాధారణ PCR ప్రారంభ ఏకాగ్రత 1.5mM (గమనిక: నిజ-సమయ పరిమాణాత్మక PCR కోసం, ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్‌తో 3 నుండి 5mM మెగ్నీషియం అయాన్ ద్రావణాన్ని ఉపయోగించండి).ఉచిత మెగ్నీషియం అయాన్ల అధిక సాంద్రతలు దిగుబడిని పెంచుతాయి, కానీ నిర్దిష్టత లేని విస్తరణను పెంచుతాయి మరియు విశ్వసనీయతను తగ్గిస్తాయి.సరైన ఏకాగ్రతను నిర్ణయించడానికి, మెగ్నీషియం అయాన్ టైట్రేషన్‌లు 1mM నుండి 3mM వరకు 0.5mM ఇంక్రిమెంట్‌లలో నిర్వహించబడ్డాయి.మెగ్నీషియం అయాన్ ఆప్టిమైజేషన్‌పై ఆధారపడటాన్ని తగ్గించడానికి, ప్లాటినం టాక్ DNA పాలిమరేస్‌ను ఉపయోగించవచ్చు.ప్లాటినం టాక్ DNA పాలిమరేస్ Taq DNA పాలిమరేస్ కంటే విస్తృతమైన మెగ్నీషియం అయాన్ సాంద్రతలలో పనితీరును నిర్వహించగలదు మరియు అందువల్ల తక్కువ ఆప్టిమైజేషన్ అవసరం.

9. Pcr-ప్రమోటింగ్ సంకలనాలు

ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత, ప్రైమర్ డిజైన్ మరియు మెగ్నీషియం అయాన్ ఏకాగ్రత యొక్క ఆప్టిమైజేషన్ చాలా టెంప్లేట్‌ల యొక్క అత్యంత నిర్దిష్ట విస్తరణకు సరిపోతుంది;అయినప్పటికీ, అధిక GC కంటెంట్‌తో సహా కొన్ని టెంప్లేట్‌లకు అదనపు చర్యలు అవసరం.DNA యొక్క ద్రవీభవన ఉష్ణోగ్రతను ప్రభావితం చేసే సంకలనాలు ఉత్పత్తి నిర్దిష్టత మరియు దిగుబడిని మెరుగుపరచడానికి మరొక మార్గాన్ని అందిస్తాయి.ఉత్తమ ఫలితాల కోసం టెంప్లేట్ యొక్క పూర్తి డీనాటరేషన్ అవసరం.

అదనంగా, ద్వితీయ నిర్మాణం ప్రైమర్ బైండింగ్ మరియు ఎంజైమ్ పొడిగింపును నిరోధిస్తుంది.

ఫార్మామైడ్, DMSO, గ్లిజరిన్, బీటైన్ మరియు PCRx ఎన్‌హాన్సర్ సొల్యూషన్‌తో సహా PCR సంకలనాలు, విస్తరణను మెరుగుపరుస్తాయి.ద్రవీభవన ఉష్ణోగ్రతను తగ్గించడం, తద్వారా ప్రైమర్‌ల ఎనియలింగ్‌కు సహాయం చేయడం మరియు ద్వితీయ నిర్మాణ ప్రాంతం ద్వారా DNA పాలిమరేస్ పొడిగింపుకు సహాయం చేయడం వారి సాధ్యమయ్యే విధానం.PCRx సొల్యూషన్ ఇతర ప్రయోజనాలను కలిగి ఉంది.ప్లాటినం టాక్ DNA పాలిమరేస్ మరియు ప్లాటినం Pfx DNA పాలిమరేస్‌తో ఉపయోగించినప్పుడు కనీస మెగ్నీషియం అయాన్ ఆప్టిమైజేషన్ అవసరం.అందువలన, ప్లాటినం సాంకేతికత మూడవ విధానం, మెగ్నీషియం అయాన్ ఆప్టిమైజేషన్ యొక్క ఆధారపడటాన్ని తగ్గించేటప్పుడు నిర్దిష్టతను పెంచడానికి సంకలితంతో కలుపుతారు.ఉత్తమ ఫలితాల కోసం, సంకలితాల ఏకాగ్రతను ఆప్టిమైజ్ చేయాలి, ముఖ్యంగా DMSO, ఫార్మామైడ్ మరియు గ్లిసరాల్, ఇవి Taq DNA పాలిమరేస్‌ను నిరోధిస్తాయి.

 ఫోర్సీ టాక్ DNA పాలిమరేస్

10. హాట్ స్టార్ట్

మంచి ప్రైమర్ డిజైన్‌తో పాటు PCR విశిష్టతను మెరుగుపరచడానికి హాట్ స్టార్ట్ PCR అత్యంత ముఖ్యమైన పద్ధతుల్లో ఒకటి.Taq DNA పాలిమరేస్ యొక్క సరైన పొడుగు ఉష్ణోగ్రత 72℃ అయినప్పటికీ, పాలిమరేస్ గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద చురుకుగా ఉంటుంది.అందువలన, PCR ప్రతిచర్య తయారీ సమయంలో మరియు ఉష్ణ చక్రం ప్రారంభంలో హోల్డింగ్ ఉష్ణోగ్రత ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత కంటే తక్కువగా ఉన్నప్పుడు నిర్దిష్ట-కాని ఉత్పత్తులు ఉత్పత్తి చేయబడతాయి.ఏర్పడిన తర్వాత, ఈ నిర్ధిష్ట ఉత్పత్తులు ప్రభావవంతంగా విస్తరించబడతాయి.ప్రైమర్ డిజైన్ కోసం ఉపయోగించే సైట్‌లు సైట్-డైరెక్ట్ మ్యుటేషన్‌లు, ఎక్స్‌ప్రెషన్ క్లోనింగ్ లేదా DNA ఇంజనీరింగ్ కోసం ఉపయోగించే జన్యు మూలకాల నిర్మాణం మరియు తారుమారు వంటి జన్యు మూలకాల స్థానం ద్వారా పరిమితం చేయబడినప్పుడు హాట్-స్టార్ట్ PCR ప్రత్యేకించి ప్రభావవంతంగా ఉంటుంది.

Taq DNA పాలిమరేస్ యొక్క కార్యకలాపాన్ని పరిమితం చేయడానికి ఒక సాధారణ పద్ధతి మంచు మీద PCR ప్రతిచర్య ద్రావణాన్ని సిద్ధం చేయడం మరియు దానిని ముందుగా వేడిచేసిన PCR ఉపకరణంలో ఉంచడం.ఈ పద్ధతి సరళమైనది మరియు చవకైనది, అయితే ఇది ఎంజైమ్ యొక్క కార్యాచరణను పూర్తి చేయదు మరియు అందువల్ల నిర్దిష్ట-కాని ఉత్పత్తుల యొక్క విస్తరణను పూర్తిగా తొలగించదు.

థర్మల్ ప్రైమింగ్ PCR ఉపకరణం డీనాటరేషన్ ఉష్ణోగ్రతకు చేరుకునే వరకు అవసరమైన భాగాన్ని నిరోధించడం ద్వారా DNA సంశ్లేషణను ఆలస్యం చేస్తుంది.Taq DNA పాలిమరేస్‌ను ఆలస్యంగా చేర్చడంతో సహా చాలా మాన్యువల్ థర్మల్ ఇనిషియేషన్ పద్ధతులు గజిబిజిగా ఉంటాయి, ముఖ్యంగా అధిక-నిర్గమాంశ అనువర్తనాలకు.ఇతర థర్మల్ ప్రైమింగ్ పద్ధతులు మెగ్నీషియం అయాన్లు లేదా ఎంజైమ్‌లతో సహా ఒక ముఖ్యమైన భాగాన్ని చుట్టుముట్టడానికి లేదా టెంప్లేట్లు మరియు బఫర్‌ల వంటి రియాక్టివ్ భాగాలను భౌతికంగా వేరుచేయడానికి మైనపు షీల్డ్‌ను ఉపయోగిస్తాయి.ఉష్ణ చక్రంలో, వివిధ భాగాలు విడుదల చేయబడతాయి మరియు మైనపు కరుగుతున్నప్పుడు కలిసిపోతాయి.మాన్యువల్ హాట్ స్టార్ట్ పద్ధతి వలె, వాక్స్ షీల్డ్ పద్ధతి గజిబిజిగా ఉంటుంది మరియు కాలుష్యానికి గురయ్యే అవకాశం ఉంది మరియు అధిక నిర్గమాంశ అనువర్తనాలకు తగినది కాదు.

ప్లాటినం DNA పాలిమరేస్ ఆటోమేటిక్ హాట్ స్టార్ట్ PCR కోసం అనుకూలమైనది మరియు సమర్థవంతమైనది.ప్లాటినం టాక్ DNA పాలిమరేస్ Taq DNA పాలిమరేస్‌కు వ్యతిరేకంగా మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీతో కలిపి రీకాంబినెంట్ Taq DNA పాలిమరేస్‌ను కలిగి ఉంటుంది.దీర్ఘకాలిక ఉష్ణోగ్రత హోల్డింగ్ సమయంలో ఎంజైమ్ కార్యకలాపాలను నిరోధించడానికి PCR ద్వారా యాంటీబాడీస్ రూపొందించబడ్డాయి.డీనాటరేషన్ స్టెప్ యొక్క 94℃ ఇన్సులేషన్ సమయంలో టాక్ DNA పాలిమరేస్ ప్రతిచర్యలోకి విడుదల చేయబడింది, ఇది పూర్తి పాలిమరేస్ కార్యాచరణను పునరుద్ధరిస్తుంది.థర్మల్ ఇనిషియేషన్ కోసం రసాయనికంగా సవరించిన Taq DNA పాలిమరేస్‌కు విరుద్ధంగా, ప్లాటినం ఎంజైమ్‌కు పాలిమరేస్‌ను సక్రియం చేయడానికి 94℃ (10 నుండి 15 నిమిషాలు) వద్ద సుదీర్ఘమైన ఇన్సులేషన్ అవసరం లేదు.PlatinumTaq DNA పాలిమరేస్‌తో, 90% Taq DNA పాలిమరేస్ కార్యాచరణ 2 నిమిషాల తర్వాత 94℃ వద్ద పునరుద్ధరించబడింది.

ఫోర్సీ HS టాక్ DNA పాలిమరేస్

11. నెస్ట్-PCR

నెస్టెడ్ ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి వరుస రౌండ్‌ల విస్తరణ నిర్దిష్టతను మరియు సున్నితత్వాన్ని మెరుగుపరుస్తుంది.మొదటి రౌండ్ 15 నుండి 20 చక్రాల ప్రామాణిక విస్తరణ.ప్రారంభ యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తి యొక్క చిన్న భాగం 100 నుండి 1000 సార్లు పలుచన చేయబడింది మరియు 15 నుండి 20 చక్రాల కోసం రెండవ రౌండ్ విస్తరణకు జోడించబడింది.ప్రత్యామ్నాయంగా, ప్రారంభ యాంప్లిఫైడ్ ఉత్పత్తిని జెల్ శుద్దీకరణ ద్వారా పరిమాణం చేయవచ్చు.రెండవ రౌండ్ యాంప్లిఫికేషన్‌లో నెస్టెడ్ ప్రైమర్ ఉపయోగించబడుతుంది, ఇది మొదటి ప్రైమర్‌లోని లక్ష్య క్రమానికి కట్టుబడి ఉంటుంది.సమూహ PCR ఉపయోగం బహుళ లక్ష్య సైట్‌ల విస్తరణ యొక్క అవకాశాన్ని తగ్గిస్తుంది ఎందుకంటే రెండు సెట్‌ల ప్రైమర్‌లకు అనుబంధంగా కొన్ని లక్ష్య శ్రేణులు ఉన్నాయి.అదే ప్రైమర్‌లతో అదే మొత్తం సైకిళ్ల సంఖ్య (30 నుండి 40) నిర్ధిష్ట సైట్‌లను విస్తరించింది.నెస్టెడ్ PCR పరిమిత లక్ష్య శ్రేణుల (ఉదా, అరుదైన mrnas) యొక్క సున్నితత్వాన్ని పెంచుతుంది మరియు క్లిష్టమైన PCRS (ఉదా 5′ RACE) యొక్క ప్రత్యేకతను మెరుగుపరుస్తుంది.

12. అవరోహణ PCR

PCR యొక్క మొదటి కొన్ని చక్రాల కోసం గట్టి ఎనియలింగ్ పరిస్థితులను ఉపయోగించడం ద్వారా అవరోహణ PCR నిర్దిష్టతను మెరుగుపరుస్తుంది.చక్రం అంచనా వేసిన Tm కంటే దాదాపు 5℃ ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత వద్ద మొదలవుతుంది, ఆపై ప్రతి చక్రం 1℃ నుండి 2℃ వరకు తగ్గించబడుతుంది మరియు ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత Tm 5℃ కంటే తక్కువగా ఉంటుంది.అత్యధిక హోమోలజీని కలిగి ఉన్న గమ్యస్థాన టెంప్లేట్ మాత్రమే విస్తరించబడుతుంది.ఈ ఉత్పత్తులు తదుపరి సైకిల్స్‌లో విస్తరిస్తూనే ఉన్నాయి, విస్తరించిన నిర్దిష్టమైన ఉత్పత్తులను విస్తరిస్తాయి.ప్రైమర్ మరియు టార్గెట్ టెంప్లేట్ మధ్య హోమోలజీ డిగ్రీ తెలియని AFLP DNA వేలిముద్ర వంటి పద్ధతులకు అవరోహణ PCR ఉపయోగపడుతుంది.

సంబంధిత PCR కిట్లు

 PCR సులభం (రంగుతో)

2× PCR హీరో^TMమిక్స్ సిస్టమ్ సాధారణ PCR మిక్స్ సిస్టమ్ కంటే PCR ఇన్హిబిటర్లకు అధిక సహనాన్ని కలిగి ఉంటుంది మరియు వివిధ సంక్లిష్ట టెంప్లేట్‌ల PCR విస్తరణను సులభంగా ఎదుర్కోగలదు.ప్రత్యేకమైన రియాక్షన్ సిస్టమ్ మరియు హై-ఎఫిషియన్సీ టాక్ హీరో PCR రియాక్షన్‌ని అధిక యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం, ​​ప్రత్యేకత మరియు సున్నితత్వం కలిగి ఉండేలా చేస్తాయి.

 PCR Heroᴹ (రంగుతో)

అధిక విస్తరణ సామర్థ్యం

ఇది 3'→5' ఎక్సోన్యూకలీస్ యాక్టివిటీ లేకుండా 5'→3' DNA పాలిమరేస్ యాక్టివిటీ మరియు 5'→3' ఎక్సోన్యూకలీస్ యాక్టివిటీని కలిగి ఉంది.

రియల్ టైమ్ PCR Easyᴹ-SYBR గ్రీన్ ఐ కిట్

నిర్దిష్ట-ఆప్టిమైజ్ చేయబడిన బఫర్ మరియు హాట్-స్టార్ట్ టాక్ ఎంజైమ్ నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ మరియు ప్రైమర్ డైమర్ ఏర్పడకుండా నిరోధించగలవు

అధిక సున్నితత్వం-టెంప్లేట్ యొక్క తక్కువ కాపీలను గుర్తించగలదు

RT-PCR సులువు I(ఒక దశ)

కిట్ ఒక ప్రత్యేకమైన ఫోర్జీన్ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ రియాజెంట్ మరియు ఫోర్‌జీన్ హాట్‌స్టార్ టాక్ DNA పాలిమరేస్‌ను ఒక ప్రత్యేకమైన రియాక్షన్ సిస్టమ్‌తో కలిపి రియాక్షన్ యొక్క యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని మరియు నిర్దిష్టతను ప్రభావవంతంగా మెరుగుపరుస్తుంది.