1. ప్రాథమిక జ్ఞానం (మీరు ప్రయోగాత్మక భాగాన్ని చూడాలనుకుంటే, దయచేసి నేరుగా రెండవ భాగానికి బదిలీ చేయండి)

సంప్రదాయ PCR యొక్క ఉత్పన్న ప్రతిచర్యగా, రియల్ టైమ్ PCR ప్రధానంగా ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్ యొక్క మార్పు ద్వారా PCR యాంప్లిఫికేషన్ ప్రతిచర్య యొక్క ప్రతి చక్రంలో యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తి మొత్తం మార్పును నిజ సమయంలో పర్యవేక్షిస్తుంది మరియు ct విలువ మరియు ప్రామాణిక వక్రరేఖ మధ్య సంబంధం ద్వారా ప్రారంభ టెంప్లేట్‌ను పరిమాణాత్మకంగా విశ్లేషిస్తుంది.

RT-PCR యొక్క నిర్దిష్ట డేటాబేస్లైన్, ఫ్లోరోసెన్స్ థ్రెషోల్డ్మరియుCt విలువ.

RT-PCR కోసం సాధారణ లేబులింగ్ పద్ధతులు:

2. ప్రయోగాత్మక దశలు

2.1 ప్రయోగాత్మక సమూహం గురించి- సమూహంలో బహుళ బావులు ఉండాలి మరియు జీవ పునరావృత్తులు ఉండాలి.

2.2 ప్రైమర్ డిజైన్ సూత్రాలు

①SiRNA జాతుల-నిర్దిష్టమైనది మరియు వివిధ జాతుల క్రమాలు భిన్నంగా ఉంటాయి.

②SiRNA ఫ్రీజ్-ఎండిన పొడిలో ప్యాక్ చేయబడింది, ఇది గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 2-4 వారాల పాటు స్థిరంగా నిల్వ చేయబడుతుంది.

2.3 ముందుగానే సిద్ధం చేయవలసిన సాధనాలు లేదా కారకాలు

2.4 నిర్దిష్ట ప్రయోగాత్మక దశల్లో శ్రద్ధ వహించాల్సిన సమస్యలకు సంబంధించి:

①siRNA బదిలీ ప్రక్రియ

1. లేపనం కోసం, మీరు 24-బావి ప్లేట్, 12-బావి ప్లేట్ లేదా 6-బావి ప్లేట్‌ను ఎంచుకోవచ్చు (24-బావి ప్లేట్‌లోని ప్రతి బావిలో ప్రతిపాదించిన సగటు RNA సాంద్రత సుమారు 100-300 ng/uL), మరియు కణాల యొక్క సరైన బదిలీ సాంద్రత 60 %-80% లేదా అంతకంటే ఎక్కువ.

2. బదిలీ దశలు మరియు నిర్దిష్ట అవసరాలు ఖచ్చితంగా సూచనలకు అనుగుణంగా ఉంటాయి.

3. బదిలీ అయిన తర్వాత, mRNA డిటెక్షన్ (RT-PCR) కోసం 24-72 గంటలలోపు నమూనాలను సేకరించవచ్చు లేదా 48-96 గంటలలోపు ప్రోటీన్ డిటెక్షన్ (WB)

② RNA వెలికితీత ప్రక్రియ

1. ఎక్సోజనస్ ఎంజైమ్‌ల ద్వారా కాలుష్యాన్ని నిరోధించండి.ఇది ప్రధానంగా ముసుగులు మరియు చేతి తొడుగులు ఖచ్చితంగా ధరించడం;క్రిమిరహితం చేయబడిన పైపెట్ చిట్కాలు మరియు EP ట్యూబ్‌లను ఉపయోగించడం;ప్రయోగంలో ఉపయోగించిన నీరు తప్పనిసరిగా RNase-రహితంగా ఉండాలి.

2. త్వరిత వెలికితీత కిట్‌లో సూచించిన విధంగా రెండుసార్లు చేయాలని సిఫార్సు చేయబడింది, ఇది నిజంగా స్వచ్ఛత మరియు దిగుబడిని మెరుగుపరుస్తుంది.

3. వ్యర్థ ద్రవం తప్పనిసరిగా RNA కాలమ్‌ను తాకకూడదు.

③ RNA పరిమాణం

RNA సంగ్రహించబడిన తర్వాత, దానిని నేరుగా నానోడ్రాప్‌తో లెక్కించవచ్చు మరియు కనీస పఠనం 10ng/ul కంటే తక్కువగా ఉంటుంది.

④ రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ప్రక్రియ

1. RT-qPCR యొక్క అధిక సున్నితత్వం కారణంగా, ప్రతి నమూనాకు కనీసం 3 సమాంతర బావులు తయారు చేయబడాలి, తదుపరి Ct చాలా భిన్నంగా ఉండకుండా లేదా గణాంక విశ్లేషణ కోసం SD చాలా పెద్దదిగా ఉండకుండా నిరోధించడానికి.

2. మాస్టర్ మిక్స్‌ను పదేపదే స్తంభింపజేయవద్దు మరియు కరిగించవద్దు.

3. ప్రతి ట్యూబ్/రంధ్రం తప్పనిసరిగా కొత్త చిట్కాతో భర్తీ చేయబడాలి!నమూనాలను జోడించడానికి అదే పైపెట్ చిట్కాను నిరంతరం ఉపయోగించవద్దు!

4. నమూనాను జోడించిన తర్వాత 96-బావి ప్లేట్‌కు జోడించిన ఫిల్మ్‌ను ప్లేట్‌తో సున్నితంగా చేయాలి.యంత్రంపై ఉంచే ముందు సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయడం ఉత్తమం, తద్వారా ట్యూబ్ గోడపై ఉన్న ద్రవం క్రిందికి ప్రవహిస్తుంది మరియు గాలి బుడగలు తొలగించబడుతుంది.

⑤కామన్ కర్వ్ విశ్లేషణ

2.5 డేటా విశ్లేషణ గురించి

qPCR యొక్క డేటా విశ్లేషణను సాపేక్ష పరిమాణం మరియు సంపూర్ణ పరిమాణీకరణగా విభజించవచ్చు.ఉదాహరణకు, నియంత్రణ సమూహంలోని కణాలతో పోలిస్తే చికిత్స సమూహంలోని కణాలు,

X జన్యువు యొక్క mRNA ఎన్ని సార్లు మారుతుంది, ఇది సాపేక్ష పరిమాణం;నిర్దిష్ట సంఖ్యలో కణాలలో, X జన్యువు యొక్క mRNA

ఎన్ని కాపీలు ఉన్నాయి, ఇది సంపూర్ణ పరిమాణం.సాధారణంగా మనం ప్రయోగశాలలో ఎక్కువగా ఉపయోగించేది సాపేక్ష పరిమాణాత్మక పద్ధతి.సాధారణంగా,2-ΔΔct పద్ధతిప్రయోగాలలో ఎక్కువగా ఉపయోగించబడుతుంది, కాబట్టి ఈ పద్ధతి మాత్రమే ఇక్కడ వివరంగా పరిచయం చేయబడుతుంది.

2-ΔΔct పద్ధతి: నియంత్రణ సమూహంలోని లక్ష్య జన్యువుకు సంబంధించి ప్రయోగాత్మక సమూహంలోని లక్ష్య జన్యువు యొక్క వ్యక్తీకరణలో వ్యత్యాసం పొందిన ఫలితం.లక్ష్య జన్యువు మరియు అంతర్గత సూచన జన్యువు రెండింటి యొక్క యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాలు 100%కి దగ్గరగా ఉండాలి మరియు సాపేక్ష విచలనం 5% మించకూడదు.

గణన పద్ధతి క్రింది విధంగా ఉంది:

Δct నియంత్రణ సమూహం = నియంత్రణ సమూహంలో లక్ష్య జన్యువు యొక్క ct విలువ - నియంత్రణ సమూహంలో అంతర్గత సూచన జన్యువు యొక్క ct విలువ

Δct ప్రయోగాత్మక సమూహం = ప్రయోగాత్మక సమూహంలోని లక్ష్య జన్యువు యొక్క ct విలువ - ప్రయోగాత్మక సమూహంలోని అంతర్గత సూచన జన్యువు యొక్క ct విలువ

ΔΔct=Δct ప్రయోగాత్మక సమూహం-Δct నియంత్రణ సమూహం

చివరగా, వ్యక్తీకరణ స్థాయిలో వ్యత్యాసం యొక్క బహుళాన్ని లెక్కించండి:

ఫోల్డ్=2-ΔΔctని మార్చండి (ఎక్సెల్ ఫంక్షన్‌కు అనుగుణంగా POWER)

సంబంధిత ఉత్పత్తులు:

సెల్ డైరెక్ట్ RT-qPCR కిట్