一, ప్రతిచర్య వ్యవస్థ యొక్క సున్నితత్వాన్ని పెంచండి:

1. అధిక నాణ్యత గల RNAను వేరుచేయండి:

విజయవంతమైన cDNA సంశ్లేషణ అధిక-నాణ్యత RNA నుండి వచ్చింది.అధిక-నాణ్యత RNA కనీసం పూర్తి-నిడివి మరియు EDTA లేదా SDS వంటి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ ఇన్హిబిటర్‌లు లేకుండా ఉండాలి.RNA యొక్క నాణ్యత మీరు cDNAలోకి లిప్యంతరీకరించగల గరిష్ట శ్రేణి సమాచారాన్ని నిర్ణయిస్తుంది.గ్వానిడిన్ ఐసోథియోసైనేట్/యాసిడ్ ఫినాల్‌ను ఉపయోగించి ఒక సాధారణ RNA శుద్దీకరణ పద్ధతి ఒక-దశ పద్ధతి.RNase యొక్క ట్రేస్ మొత్తాల ద్వారా కలుషితం కాకుండా నిరోధించడానికి, RNase-రిచ్ శాంపిల్స్ (ప్యాంక్రియాస్ వంటివి) నుండి వేరుచేయబడిన RNA అధిక-నాణ్యత RNAను సంరక్షించడానికి, ముఖ్యంగా దీర్ఘకాలిక నిల్వ కోసం ఫార్మాల్డిహైడ్‌లో నిల్వ చేయాలి.ఎలుక కాలేయం నుండి సేకరించిన RNA ప్రాథమికంగా ఒక వారం నీటిలో నిల్వ చేయబడిన తర్వాత క్షీణించింది, అయితే ఎలుక ప్లీహము నుండి సేకరించిన RNA 3 సంవత్సరాల పాటు నీటిలో నిల్వ చేయబడిన తర్వాత స్థిరంగా ఉంటుంది.అదనంగా, చిన్న ట్రాన్‌స్క్రిప్ట్‌ల కంటే 4 kb కంటే ఎక్కువ పొడవు గల ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు ట్రేస్ RNases ద్వారా అధోకరణానికి ఎక్కువ సున్నితంగా ఉంటాయి.నిల్వ చేయబడిన RNA నమూనాల స్థిరత్వాన్ని పెంచడానికి, RNAను డీయోనైజ్డ్ ఫార్మామైడ్‌లో కరిగించి -70°C వద్ద నిల్వ చేయవచ్చు.ఆర్‌ఎన్‌ఏను భద్రపరచడానికి ఉపయోగించే ఫార్మామైడ్ తప్పనిసరిగా ఆర్‌ఎన్‌ఏ-డిగ్రేడింగ్ చెత్త లేకుండా ఉండాలి.ప్యాంక్రియాస్ నుండి వచ్చే RNA కనీసం ఒక సంవత్సరం పాటు ఫార్మామైడ్‌లో భద్రపరచబడుతుంది.RNAని ఉపయోగించడానికి సిద్ధమవుతున్నప్పుడు, మీరు RNAను అవక్షేపించడానికి క్రింది పద్ధతిని ఉపయోగించవచ్చు: NaClని 0.2Mకి మరియు 4 రెట్లు ఇథనాల్ వాల్యూమ్‌కు జోడించండి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 3-5 నిమిషాలు ఉంచండి మరియు 5 నిమిషాలకు 10,000×g వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయండి.

2. RNaseH-ఇనాక్టివ్ (RNaseH-) రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ ఉపయోగించండి:

cDNA సంశ్లేషణ యొక్క పొడవు మరియు దిగుబడిని పెంచడానికి RNase ఇన్హిబిటర్లు తరచుగా రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ప్రతిచర్యలకు జోడించబడతాయి.బఫర్ మరియు తగ్గించే ఏజెంట్ (DTT వంటివి) సమక్షంలో మొదటి-స్ట్రాండ్ సంశ్లేషణ ప్రతిచర్య సమయంలో RNase ఇన్హిబిటర్‌లను జోడించాలి, ఎందుకంటే cDNA సంశ్లేషణకు ముందు ప్రక్రియ నిరోధకాన్ని నిర్వీర్యం చేస్తుంది, తద్వారా RNA క్షీణింపజేసే కట్టుబడి ఉన్న RNase విడుదల అవుతుంది.ప్రొటీన్ RNase ఇన్హిబిటర్లు RNase A, B, C ద్వారా RNA క్షీణతను మాత్రమే నిరోధిస్తాయి మరియు చర్మంపై RNaseని నిరోధించవు, కాబట్టి ఈ ఇన్హిబిటర్లను ఉపయోగించినప్పటికీ మీ వేళ్ల నుండి RNaseని ప్రవేశపెట్టకుండా జాగ్రత్త వహించండి.

రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ RNAను cDNAగా మార్చడాన్ని ఉత్ప్రేరకపరుస్తుంది.M-MLV మరియు AMV రెండూ వాటి స్వంత పాలిమరేస్ కార్యకలాపంతో పాటు అంతర్జాత RNaseH కార్యాచరణను కలిగి ఉంటాయి.RNaseH కార్యాచరణ మరియు పాలీమరేస్ కార్యాచరణ RNA టెంప్లేట్ మరియు DNA ప్రైమర్ లేదా cDNA పొడిగింపు స్ట్రాండ్ మధ్య ఏర్పడిన హైబ్రిడ్ స్ట్రాండ్ కోసం ఒకదానితో ఒకటి పోటీపడతాయి మరియు RNA:DNA కాంప్లెక్స్‌లో RNA స్ట్రాండ్‌ను దిగజార్చాయి.RNaseH కార్యాచరణ ద్వారా క్షీణించిన RNA టెంప్లేట్ ఇకపై cDNA సంశ్లేషణకు ప్రభావవంతమైన సబ్‌స్ట్రేట్‌గా పనిచేయదు, ఇది cDNA సంశ్లేషణ యొక్క దిగుబడి మరియు పొడవును తగ్గిస్తుంది.అందువల్ల, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ యొక్క RNaseH కార్యాచరణను తొలగించడం లేదా బాగా తగ్గించడం ప్రయోజనకరంగా ఉంటుంది.

సూపర్‌స్క్రిప్ట్ Ⅱ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్, RNaseH- MMLV రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ మరియు థర్మోస్క్రిప్ట్ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్, RNaseH- AMV, MMLV మరియు AMV కంటే ఎక్కువ మొత్తం మరియు పూర్తి-నిడివి గల cDNAని పొందవచ్చు.RT-PCR సున్నితత్వం cDNA సంశ్లేషణ మొత్తం ద్వారా ప్రభావితమవుతుంది.AMV కంటే థర్మోస్క్రిప్ట్ చాలా సున్నితమైనది.RT-PCR ఉత్పత్తుల పరిమాణం cDNAను సంశ్లేషణ చేయడానికి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ సామర్థ్యం ద్వారా పరిమితం చేయబడింది, ప్రత్యేకించి పెద్ద cDNAలను క్లోనింగ్ చేసేటప్పుడు.MMLVతో పోలిస్తే, SuperScripⅡ సుదీర్ఘ RT-PCR ఉత్పత్తుల దిగుబడిని గణనీయంగా పెంచింది.RNaseH-రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ కూడా థర్మోస్టబిలిటీని పెంచింది, కాబట్టి ప్రతిచర్య సాధారణ 37-42°C కంటే ఎక్కువ ఉష్ణోగ్రతల వద్ద నిర్వహించబడుతుంది.సూచించబడిన సంశ్లేషణ పరిస్థితులలో, ఒలిగో(dT) ప్రైమర్ మరియు [α-P]dCTP యొక్క 10 μCiని ఉపయోగించండి.మొదటి స్ట్రాండ్ యొక్క మొత్తం దిగుబడి TCA అవక్షేప పద్ధతిని ఉపయోగించి లెక్కించబడుతుంది.పూర్తి-నిడివి గల cDNA పరిమాణం-క్రమబద్ధీకరించబడిన బ్యాండ్‌లను ఉపయోగించి విశ్లేషించబడింది మరియు ఆల్కలీన్ అగరోజ్ జెల్‌పై లెక్కించబడుతుంది.

3. రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కోసం పొదిగే ఉష్ణోగ్రతను పెంచండి:

అధిక పొదిగే ఉష్ణోగ్రత RNA ద్వితీయ నిర్మాణాన్ని తెరవడానికి సహాయపడుతుంది, ప్రతిచర్య యొక్క దిగుబడిని పెంచుతుంది.చాలా RNA టెంప్లేట్‌ల కోసం, బఫర్ లేదా ఉప్పు లేకుండా 65°C వద్ద RNA మరియు ప్రైమర్‌లను పొదిగించడం, ఆ తర్వాత మంచుపై వేగవంతమైన శీతలీకరణ చాలా ద్వితీయ నిర్మాణాలను తొలగిస్తుంది మరియు ప్రైమర్‌లను బంధించడానికి అనుమతిస్తుంది.అయినప్పటికీ, కొన్ని టెంప్లేట్‌లు హీట్ డీనాటరేషన్ తర్వాత కూడా ద్వితీయ నిర్మాణాలను కలిగి ఉంటాయి.థర్మోస్క్రిప్ట్ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్‌ని ఉపయోగించి మరియు యాంప్లిఫికేషన్‌ను మెరుగుపరచడానికి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ రియాక్షన్‌ను అధిక ఉష్ణోగ్రత వద్ద ఉంచడం ద్వారా ఈ కష్టమైన టెంప్లేట్‌ల విస్తరణను నిర్వహించవచ్చు.అధిక పొదిగే ఉష్ణోగ్రతలు కూడా నిర్దిష్టతను పెంచుతాయి, ప్రత్యేకించి cDNA సంశ్లేషణ కోసం జన్యు-నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌లను (GSP) ఉపయోగించినప్పుడు (చాప్టర్ 3 చూడండి).GSPని ఉపయోగిస్తుంటే, ప్రైమర్‌ల Tm ఆశించిన ఇంక్యుబేషన్ ఉష్ణోగ్రతకు సమానంగా ఉండేలా చూసుకోండి.ఒలిగో(dT) మరియు 60°C కంటే ఎక్కువ రాండమ్ ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించవద్దు.యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్‌లకు 60°Cకి పెంచడానికి ముందు 10 నిమిషాల పాటు 25°C వద్ద ఇంక్యుబేషన్ అవసరం.అధిక రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ఉష్ణోగ్రతను ఉపయోగించడంతో పాటు, RNA/ప్రైమర్ మిశ్రమాన్ని 65°C డీనాటరేషన్ ఉష్ణోగ్రత నుండి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ఇంక్యుబేషన్ ఉష్ణోగ్రతకు నేరుగా బదిలీ చేయడం ద్వారా మరియు ముందుగా వేడెక్కిన 2× ప్రతిచర్య మిశ్రమాన్ని (cDNA హాట్-స్టార్ట్ సింథసిస్) జోడించడం ద్వారా కూడా నిర్దిష్టతను మెరుగుపరచవచ్చు.ఈ విధానం తక్కువ ఉష్ణోగ్రతల వద్ద సంభవించే ఇంటర్‌మోలిక్యులర్ బేస్ జతను నిరోధించడంలో సహాయపడుతుంది.RT-PCR కోసం అవసరమైన బహుళ ఉష్ణోగ్రత మార్పిడిని థర్మల్ సైక్లర్‌ని ఉపయోగించడం ద్వారా సరళీకరించవచ్చు.

Tth థర్మోస్టేబుల్ పాలిమరేస్ Mg2+ సమక్షంలో DNA పాలిమరేస్‌గా మరియు Mn2+ సమక్షంలో RNA పాలిమరేస్‌గా పనిచేస్తుంది.ఇది గరిష్టంగా 65 ° C ఉష్ణోగ్రత వద్ద వెచ్చగా ఉంచబడుతుంది.అయినప్పటికీ, PCR సమయంలో Mn2+ ఉండటం విశ్వసనీయతను తగ్గిస్తుంది, ఇది cDNA యొక్క క్లోనింగ్ వంటి అధిక-ఖచ్చితమైన విస్తరణకు Tth పాలిమరేస్‌ను తక్కువ అనుకూలంగా చేస్తుంది.అదనంగా, Tth తక్కువ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉంది, ఇది సున్నితత్వాన్ని తగ్గిస్తుంది మరియు రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ మరియు PCR ఒకే ఎంజైమ్‌తో చేయవచ్చు కాబట్టి, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ లేకుండా నియంత్రణ ప్రతిచర్యలు cDNA యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తులను కలుషిత జన్యుసంబంధమైన DNAతో పోల్చడానికి ఉపయోగించబడవు.యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తులు వేరు చేయబడ్డాయి.

4. రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌ను ప్రోత్సహించే సంకలనాలు:

గ్లిసరాల్ మరియు DMSOతో సహా సంకలనాలు మొదటి-స్ట్రాండ్ సంశ్లేషణ ప్రతిచర్యకు జోడించబడతాయి, ఇది న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ డబుల్-స్ట్రాండ్ యొక్క స్థిరత్వాన్ని తగ్గిస్తుంది మరియు RNA యొక్క ద్వితీయ నిర్మాణాన్ని విప్పుతుంది.సూపర్‌స్క్రిప్ట్ II లేదా MMLV కార్యాచరణను ప్రభావితం చేయకుండా 20% గ్లిసరాల్ లేదా 10% DMSO వరకు జోడించవచ్చు.AMV కూడా 20% వరకు గ్లిసరాల్‌ను చర్య కోల్పోకుండా తట్టుకోగలదు.సూపర్‌స్క్రిప్ట్Ⅱ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ రియాక్షన్‌లో RT-PCR యొక్క సున్నితత్వాన్ని పెంచడానికి, 10% గ్లిసరాల్‌ను జోడించి, 45°C వద్ద పొదిగించవచ్చు.రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ రియాక్షన్ ప్రొడక్ట్‌లో 1/10 PCRకి జోడించబడితే, అప్పుడు యాంప్లిఫికేషన్ రియాక్షన్‌లో గ్లిసరాల్ యొక్క గాఢత 0.4% ఉంటుంది, ఇది PCRని నిరోధించడానికి సరిపోదు.

5. RNaseH చికిత్స:

PCRకి ముందు RNaseHతో cDNA సంశ్లేషణ ప్రతిచర్యల చికిత్స సున్నితత్వాన్ని పెంచుతుంది.కొన్ని టెంప్లేట్‌ల కోసం, cDNA సింథసిస్ రియాక్షన్‌లోని RNA యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తుల బైండింగ్‌ను నిరోధిస్తుంది, ఈ సందర్భంలో RNaseH చికిత్స సున్నితత్వాన్ని పెంచుతుంది.సాధారణంగా, తక్కువ-కాపీ ట్యూబరస్ స్కెరోసిస్ II వంటి పొడవైన పూర్తి-నిడివి గల cDNA లక్ష్య టెంప్లేట్‌లను విస్తరించేటప్పుడు RNaseH చికిత్స అవసరం.ఈ కష్టమైన టెంప్లేట్ కోసం, RNaseH చికిత్స సూపర్‌స్క్రిప్ట్ II లేదా AMV-సింథసైజ్డ్ cDNA ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన సిగ్నల్‌ను మెరుగుపరిచింది.చాలా RT-PCR ప్రతిచర్యలకు, RNaseH చికిత్స ఐచ్ఛికం, ఎందుకంటే 95°C వద్ద PCR డీనాటరేషన్ దశ సాధారణంగా RNA:DNA కాంప్లెక్స్‌లో RNAను హైడ్రోలైజ్ చేస్తుంది.

6. స్మాల్ RNA డిటెక్షన్ మెథడ్ యొక్క మెరుగుదల:

కేవలం తక్కువ మొత్తంలో RNA మాత్రమే అందుబాటులో ఉన్నప్పుడు RT-PCR ముఖ్యంగా సవాలుగా ఉంటుంది.RNA ఐసోలేషన్ సమయంలో క్యారియర్‌గా జోడించబడిన గ్లైకోజెన్ చిన్న నమూనాల దిగుబడిని పెంచడానికి సహాయపడుతుంది.ట్రైజోల్‌ని జోడించే సమయంలోనే RNase-రహిత గ్లైకోజెన్‌ని జోడించవచ్చు.గ్లైకోజెన్ నీటిలో కరిగేది మరియు తదుపరి అవపాతానికి సహాయం చేయడానికి RNAతో సజల దశలో ఉంచబడుతుంది.50 mg కణజాలం లేదా 106 కల్చర్డ్ కణాల కంటే తక్కువ నమూనాల కోసం, RNase-రహిత గ్లైకోజెన్ యొక్క సిఫార్సు ఏకాగ్రత 250 μg/ml.

సూపర్‌స్క్రిప్ట్ IIని ఉపయోగించి రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ రియాక్షన్‌కి ఎసిటైలేటెడ్ BSAని జోడించడం వలన సున్నితత్వం పెరుగుతుంది మరియు తక్కువ మొత్తంలో RNA కోసం, సూపర్‌స్క్రిప్ట్ II మొత్తాన్ని తగ్గించడం మరియు RNaseOut న్యూక్లీస్ ఇన్హిబిటర్ యొక్క 40 యూనిట్లను జోడించడం ద్వారా గుర్తింపు స్థాయిని పెంచవచ్చు.RNA ఐసోలేషన్ ప్రాసెస్‌లో గ్లైకోజెన్ ఉపయోగించబడితే, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ రియాక్షన్ కోసం సూపర్‌స్క్రిప్ట్ IIని ఉపయోగిస్తున్నప్పుడు BSA లేదా RNase ఇన్‌హిబిటర్‌ని జోడించాలని ఇప్పటికీ సిఫార్సు చేయబడింది.

RT-PCR విశిష్టతను పెంచండి

1. CND సంశ్లేషణ:

మొదటి-స్ట్రాండ్ cDNA సంశ్లేషణను మూడు వేర్వేరు పద్ధతులను ఉపయోగించి ప్రారంభించవచ్చు, దీని యొక్క సాపేక్ష విశిష్టత సంశ్లేషణ చేయబడిన cDNA మొత్తం మరియు రకాన్ని ప్రభావితం చేస్తుంది.

రాండమ్ ప్రైమర్ పద్ధతి మూడు పద్ధతుల్లో అతి తక్కువ నిర్దిష్టమైనది.ప్రైమర్‌లు ట్రాన్‌స్క్రిప్ట్ అంతటా బహుళ సైట్‌లలో అనెయల్, చిన్న, పాక్షిక-పొడవు cDNAలను ఉత్పత్తి చేస్తాయి.ఈ పద్ధతి తరచుగా 5′ ముగింపు సీక్వెన్స్‌లను పొందేందుకు మరియు సెకండరీ స్ట్రక్చర్ యొక్క ప్రాంతాలతో లేదా రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్ ద్వారా ప్రతిరూపం చేయలేని టెర్మినేషన్ సైట్‌లతో RNA టెంప్లేట్‌ల నుండి cDNA పొందేందుకు తరచుగా ఉపయోగించబడుతుంది.పొడవైన cDNAని పొందేందుకు, ప్రతి RNA నమూనాలో ప్రైమర్‌ల నిష్పత్తిని RNAకి అనుభావికంగా నిర్ణయించాలి.యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్‌ల ప్రారంభ సాంద్రత 20 μl ప్రతిచర్యకు 50 నుండి 250 ng వరకు ఉంటుంది.యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి మొత్తం RNA నుండి సంశ్లేషణ చేయబడిన cDNA ప్రాథమికంగా రైబోసోమల్ RNA కాబట్టి, పాలీ(A)+RNA సాధారణంగా టెంప్లేట్‌గా ఎంపిక చేయబడుతుంది.

ఒలిగో(dT) ప్రైమర్‌లు యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్‌ల కంటే మరింత నిర్దిష్టంగా ఉంటాయి.ఇది చాలా యూకారియోటిక్ mRNAల యొక్క 3′ చివర కనిపించే పాలీ(A) తోకకు సంకరం చేస్తుంది.పాలీ(A)+ RNA మొత్తం RNAలో సుమారుగా 1% నుండి 2% ఉన్నందున, cDNA మొత్తం మరియు సంక్లిష్టత యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్‌లతో పోలిస్తే చాలా తక్కువగా ఉంటుంది.దాని అధిక నిర్దిష్టత కారణంగా, ఒలిగో(dT)కి సాధారణంగా RNA మరియు ప్రైమర్‌ల నిష్పత్తి మరియు పాలీ(A)+ ఎంపిక యొక్క ఆప్టిమైజేషన్ అవసరం లేదు.20μl ప్రతిచర్య వ్యవస్థకు 0.5μg ఒలిగో(dT)ని ఉపయోగించమని సిఫార్సు చేయబడింది.ఒలిగో(dT)12-18 చాలా RT-PCRకి అనుకూలంగా ఉంటుంది.థర్మోస్క్రిప్ట్ RT-PCR సిస్టమ్ ఒలిగో(dT)20ని అందిస్తుంది ఎందుకంటే అధిక పొదిగే ఉష్ణోగ్రతల కోసం దాని మెరుగైన ఉష్ణ స్థిరత్వం.

జీన్ స్పెసిఫిక్ ప్రైమర్‌లు (GSP) రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ స్టెప్‌కు అత్యంత నిర్దిష్టమైన ప్రైమర్‌లు.GSP అనేది యాంటిసెన్స్ ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్, ఇది రాండమ్ ప్రైమర్‌లు లేదా ఒలిగో(dT) లాగా కాకుండా, అన్ని RNAలకు అనీల్ చేసే RNA లక్ష్య శ్రేణికి ప్రత్యేకంగా హైబ్రిడైజ్ చేయగలదు.PCR ప్రైమర్‌లను రూపొందించడానికి ఉపయోగించే అదే నియమాలు రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ప్రతిచర్యలలో GSP రూపకల్పనకు వర్తిస్తాయి.GSP అనేది mRNA యొక్క 3′-అత్యంత చివర వరకు ఉండే యాంప్లిఫికేషన్ ప్రైమర్ వలె అదే క్రమాన్ని కలిగి ఉంటుంది లేదా GSPని రివర్స్ యాంప్లిఫికేషన్ ప్రైమర్ దిగువకు ఎనియల్ చేయడానికి రూపొందించబడుతుంది.కొన్ని యాంప్లిఫైడ్ సబ్జెక్ట్‌ల కోసం, విజయవంతమైన RT-PCR కోసం ఒకటి కంటే ఎక్కువ యాంటిసెన్స్ ప్రైమర్‌లను రూపొందించాలి ఎందుకంటే టార్గెట్ RNA యొక్క ద్వితీయ నిర్మాణం ప్రైమర్ బైండింగ్‌ను నిరోధించవచ్చు.20 μl ఫస్ట్-స్ట్రాండ్ సింథసిస్ రియాక్షన్‌లో 1 pmol యాంటిసెన్స్ GSPని ఉపయోగించమని సిఫార్సు చేయబడింది.

2. రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కోసం ఇంక్యుబేషన్ ఉష్ణోగ్రతను పెంచండి:

GSP నిర్దిష్టత యొక్క పూర్తి ప్రయోజనాన్ని పొందేందుకు, అధిక థర్మోస్టబిలిటీతో కూడిన రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్‌ని ఉపయోగించాలి.థర్మోస్టేబుల్ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్‌లు ప్రతిచర్య కఠినతను పెంచడానికి అధిక ఉష్ణోగ్రతల వద్ద పొదిగేవి.ఉదాహరణకు, ఒక GSP 55°C వద్ద ఉంటే, AMV లేదా M-MLVని 37°C తక్కువ స్ట్రింజెన్సీ వద్ద రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కోసం ఉపయోగించినట్లయితే, GSP యొక్క నిర్దిష్టత పూర్తిగా ఉపయోగించబడదు.అయినప్పటికీ, సూపర్‌స్క్రిప్ట్ II మరియు థర్మోస్క్రిప్ట్‌లు 50°C లేదా అంతకంటే ఎక్కువ ఉష్ణోగ్రత వద్ద ప్రతిస్పందిస్తాయి, ఇది తక్కువ ఉష్ణోగ్రతల వద్ద ఉత్పత్తి చేయబడిన నిర్దిష్ట-కాని ఉత్పత్తులను తొలగిస్తుంది.గరిష్ట నిర్దిష్టత కోసం, RNA/ప్రైమర్ మిశ్రమాన్ని 65°C డీనాటరేషన్ ఉష్ణోగ్రత నుండి నేరుగా రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ఇంక్యుబేషన్ ఉష్ణోగ్రతకు బదిలీ చేయవచ్చు మరియు ముందుగా వేడెక్కిన 2× ప్రతిచర్య మిశ్రమానికి (cDNA సింథసిస్ హాట్ స్టార్ట్) జోడించబడుతుంది.ఇది తక్కువ ఉష్ణోగ్రతల వద్ద ఇంటర్‌మోలిక్యులర్ బేస్ జత చేయడాన్ని నిరోధించడంలో సహాయపడుతుంది.RT-PCR కోసం అవసరమైన బహుళ ఉష్ణోగ్రత పరివర్తనలను థర్మల్ సైక్లర్‌ని ఉపయోగించడం ద్వారా సరళీకరించవచ్చు.

3. జన్యుసంబంధమైన DNA కాలుష్యాన్ని తగ్గిస్తుంది

RT-PCRతో ఎదురయ్యే సంభావ్య సమస్య RNAలో జన్యుసంబంధమైన DNA యొక్క కాలుష్యం.ట్రైజోల్ రీజెంట్ వంటి మంచి RNA ఐసోలేషన్ పద్ధతిని ఉపయోగించడం వలన RNA తయారీని కలుషితం చేసే జన్యుసంబంధమైన DNA మొత్తం తగ్గుతుంది.జన్యుసంబంధమైన DNA నుండి ఉత్పన్నమైన ఉత్పత్తులను నివారించడానికి, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌కు ముందు కలుషితమైన DNAని తొలగించడానికి RNAను యాంప్లిఫికేషన్-గ్రేడ్ DNase Iతో చికిత్స చేయవచ్చు.నమూనాలను 2.0 mM EDTAలో 10 నిమిషాల పాటు 65°C వద్ద పొదిగించడం ద్వారా DNase I జీర్ణక్రియ ముగిసింది.EDTA మెగ్నీషియం అయాన్లను చీలేట్ చేయగలదు, అధిక ఉష్ణోగ్రతల వద్ద మెగ్నీషియం అయాన్-ఆధారిత RNA జలవిశ్లేషణను నివారిస్తుంది.

జన్యుసంబంధమైన DNA యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తులను కలుషితం చేయకుండా విస్తరించిన cDNAని వేరు చేయడానికి, ప్రైమర్‌లను ప్రతి ఒక్కటి ఎక్సోన్‌లను వేరు చేసేలా రూపొందించవచ్చు.cDNA నుండి తీసుకోబడిన PCR ఉత్పత్తులు కలుషితమైన జన్యుసంబంధమైన DNA నుండి తీసుకోబడిన వాటి కంటే తక్కువగా ఉంటాయి.అదనంగా, ప్రతి RNA టెంప్లేట్‌పై రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ లేకుండా ఒక నియంత్రణ ప్రయోగం నిర్వహించబడింది, ఇచ్చిన భాగం జన్యుసంబంధమైన DNA లేదా cDNA నుండి ఉద్భవించబడిందో లేదో నిర్ధారించడానికి.రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ లేకుండా పొందిన PCR ఉత్పత్తి జన్యువు నుండి తీసుకోబడింది.