ప్రారంభ పదార్థం: RNA
క్వాంటిటేటివ్ రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ PCR (RT-qPCR) అనేది PCR ప్రయోగాలలో RNAను ప్రారంభ పదార్థంగా ఉపయోగించి ఉపయోగించే ఒక ప్రయోగాత్మక పద్ధతి.ఈ పద్ధతిలో, మొత్తం RNA లేదా మెసెంజర్ RNA (mRNA) మొదట రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్టేజ్ ద్వారా కాంప్లిమెంటరీ DNA (cDNA)లోకి లిప్యంతరీకరించబడుతుంది.తదనంతరం, cDNAని టెంప్లేట్గా ఉపయోగించి qPCR ప్రతిచర్య జరిగింది.RT-qPCR జన్యు వ్యక్తీకరణ విశ్లేషణ, RNA జోక్యం ధ్రువీకరణ, మైక్రోఅరే ధ్రువీకరణ, వ్యాధికారక గుర్తింపు, జన్యు పరీక్ష మరియు వ్యాధి పరిశోధనలతో సహా వివిధ పరమాణు జీవశాస్త్ర అనువర్తనాల్లో ఉపయోగించబడింది.
RT-qPCR కోసం ఒక-దశ మరియు రెండు-దశల పద్ధతులు
RT-qPCR ఒక-దశ లేదా రెండు-దశల పద్ధతి ద్వారా సాధించబడుతుంది.వన్-స్టెప్ RT-qPCR రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ మరియు PCR యాంప్లిఫికేషన్ను మిళితం చేస్తుంది, రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్టేజ్ మరియు DNA పాలిమరేస్లు అదే బఫర్ పరిస్థితుల్లో ఒకే ట్యూబ్లో ప్రతిచర్యను పూర్తి చేయడానికి అనుమతిస్తుంది.ఒక-దశ RT-qPCRకి సీక్వెన్స్-నిర్దిష్ట ప్రైమర్ల ఉపయోగం మాత్రమే అవసరం.రెండు-దశల RT-qPCRలో, రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ మరియు PCR యాంప్లిఫికేషన్ రెండు ట్యూబ్లలో నిర్వహించబడతాయి, విభిన్న ఆప్టిమైజ్ చేయబడిన బఫర్లు, ప్రతిచర్య పరిస్థితులు మరియు ప్రైమర్ డిజైన్ వ్యూహాలను ఉపయోగిస్తాయి.
అడ్వాంటేజ్ | ప్రతికూలత | |
ఒక్క అడుగు | రెండు ప్రతిచర్యలు ఒకే ట్యూబ్లో జరుగుతాయి కాబట్టి ఈ పద్ధతిలో తక్కువ ప్రయోగాత్మక లోపం ఉంది
తక్కువ పైప్టింగ్ దశలు కాలుష్య ప్రమాదాన్ని తగ్గిస్తాయి
హై-త్రూపుట్ యాంప్లిఫికేషన్/స్క్రీనింగ్, వేగవంతమైన మరియు పునరుత్పత్తికి అనుకూలం | రెండు-దశల ప్రతిచర్యలు విడిగా ఆప్టిమైజ్ చేయబడవు
రెండు-దశల ప్రతిచర్యను కలపడం ద్వారా ప్రతిచర్య పరిస్థితులు రాజీపడతాయి కాబట్టి, సున్నితత్వం రెండు-దశల పద్ధతి వలె మంచిది కాదు
ఒకే నమూనా ద్వారా గుర్తించబడిన లక్ష్యాల సంఖ్య చిన్నది |
రెండు దశలు | స్థిరమైన cDNA లైబ్రరీలను సృష్టించగల సామర్థ్యం చాలా కాలం పాటు నిల్వ చేయబడుతుంది మరియు బహుళ ప్రతిచర్యలలో ఉపయోగించబడుతుంది
బహుళ cDNA లైబ్రరీల అవసరం లేకుండా ఒకే cDNA లైబ్రరీ నుండి లక్ష్య జన్యువులు మరియు సూచన జన్యువులను విస్తరించవచ్చు
సింగిల్ రియాక్షన్ పరుగుల ఆప్టిమైజేషన్ని ఎనేబుల్ చేసే రియాక్షన్ బఫర్లు మరియు రియాక్షన్ పరిస్థితులు
ట్రిగ్గర్ పరిస్థితుల యొక్క సౌకర్యవంతమైన ఎంపిక | బహుళ ట్యూబ్లను ఉపయోగించడం మరియు మరిన్ని పైప్టింగ్ దశలు DNA కాలుష్యం యొక్క ప్రమాదాన్ని పెంచుతుంది, మరియు సమయం తీసుకుంటుంది.
ఒక-దశ పద్ధతి కంటే ఎక్కువ ఆప్టిమైజేషన్ అవసరం |
సంబంధిత ఉత్పత్తులు:
RT-qPCR సులువు (ఒక దశ)-SYBR గ్రీన్ I
ఫస్ట్-స్ట్రాండ్ CDNA సింథసిస్ కోసం RT ఈజీ I మాస్టర్ ప్రీమిక్స్
రియల్ టైమ్ PCR Easyᴹ-SYBR గ్రీన్ ఐ కిట్
మొత్తం RNA మరియు mRNA ఎంపిక
RT-qPCR ప్రయోగాన్ని డిజైన్ చేస్తున్నప్పుడు, రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కోసం టెంప్లేట్గా మొత్తం RNA లేదా శుద్ధి చేయబడిన mRNAని ఉపయోగించాలా వద్దా అని నిర్ణయించుకోవడం ముఖ్యం.mRNA కొంచెం ఎక్కువ సున్నితత్వాన్ని అందించగలిగినప్పటికీ, మొత్తం RNA ఇప్పటికీ తరచుగా ఉపయోగించబడుతుంది.దీనికి కారణం mRNA కంటే మొత్తం RNA ఒక ప్రారంభ పదార్థంగా చాలా ముఖ్యమైన ప్రయోజనాన్ని కలిగి ఉంది.ముందుగా, ప్రక్రియకు తక్కువ శుద్దీకరణ దశలు అవసరమవుతాయి, ఇది టెంప్లేట్ యొక్క మెరుగైన పరిమాణాత్మక పునరుద్ధరణను మరియు సెల్ సంఖ్యలను ప్రారంభించడానికి ఫలితాలను మెరుగైన సాధారణీకరణను నిర్ధారిస్తుంది.రెండవది, ఇది mRNA సుసంపన్నత దశను నివారిస్తుంది, ఇది వివిధ mRNAల యొక్క విభిన్న పునరుద్ధరణల కారణంగా వక్రీకృత ఫలితాల అవకాశాన్ని నివారించవచ్చు.మొత్తంమీద, చాలా అనువర్తనాల్లో గుర్తించే సంపూర్ణ సున్నితత్వం కంటే లక్ష్య జన్యువు యొక్క సాపేక్ష పరిమాణీకరణ చాలా ముఖ్యమైనది కాబట్టి, చాలా సందర్భాలలో మొత్తం RNA మరింత అనుకూలంగా ఉంటుంది.
రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ప్రైమర్
రెండు-దశల పద్ధతిలో, cDNA ప్రతిచర్యను ప్రైమ్ చేయడానికి మూడు వేర్వేరు పద్ధతులను ఉపయోగించవచ్చు: ఒలిగో(dT) ప్రైమర్లు, రాండమ్ ప్రైమర్లు లేదా సీక్వెన్స్-స్పెసిఫిక్ ప్రైమర్లు.సాధారణంగా, ఒలిగో(dT) ప్రైమర్లు మరియు యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్లు కలయికలో ఉపయోగించబడతాయి.ఈ ప్రైమర్లు టెంప్లేట్ mRNA స్ట్రాండ్కు అనీల్ చేస్తాయి మరియు సంశ్లేషణ కోసం ప్రారంభ బిందువుతో రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్టేజ్ను అందిస్తాయి.
ప్రైమర్ ఎంపిక | నిర్మాణం మరియు పనితీరు | అడ్వాంటేజ్ | ప్రతికూలత |
ఒలిగో(డిటి) ప్రైమర్ (లేదా యాంకర్డ్ ఒలిగో (డిటి) ప్రైమర్) | mRNA యొక్క పాలీ(A) తోక వద్ద థైమిన్ అవశేషాలకు విస్తరించిన ఎనియలింగ్;యాంకర్ ఒలిగో(dT) ప్రైమర్లో 3′ చివరలో G, C లేదా A ఉంటుంది (యాంకర్ సైట్) | పాలీ(A)-టెయిల్డ్ mRNA నుండి పూర్తి-నిడివి గల cDNA సంశ్లేషణ
తక్కువ ప్రారంభ మెటీరియల్ అందుబాటులో ఉన్నప్పుడు వర్తిస్తుంది
యాంకరింగ్ సైట్ ఒలిగో(dT) ప్రైమర్ mRNA యొక్క 5′ పాలీ(A) తోకకు కట్టుబడి ఉండేలా చేస్తుంది | పాలీ(A) తోకలతో జన్యువులను విస్తరించడానికి మాత్రమే సరిపోతుంది
పాలీ(A)లో ప్రైమింగ్ సైట్*2 నుండి కత్తిరించబడిన cDNA పొందండి
3′ ముగింపు*కి బంధించడానికి పక్షపాతం
*ఎంకరేజ్ చేసిన ఒలిగో(dT) ప్రైమర్లను ఉపయోగించినట్లయితే ఈ అవకాశం తగ్గించబడుతుంది |
యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్
| 6 నుండి 9 బేస్ల పొడవు, ఇది RNA ట్రాన్స్క్రిప్షన్ సమయంలో బహుళ సైట్లకు ఎనియల్ చేయగలదు | అన్ని RNAలు (tRNA, rRNA మరియు mRNA)
ముఖ్యమైన ద్వితీయ నిర్మాణంతో లేదా తక్కువ ప్రారంభ మెటీరియల్ అందుబాటులో ఉన్నప్పుడు ట్రాన్స్క్రిప్ట్లకు అనుకూలం
అధిక cDNA దిగుబడి | cDNA మొత్తం RNA నుండి రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్ చేయబడింది, ఇది సాధారణంగా కోరుకోదు మరియు లక్ష్యం mRNA యొక్క సిగ్నల్ను పలుచన చేయవచ్చు
కత్తిరించబడిన cDNA పొందండి |
క్రమం-నిర్దిష్ట ప్రైమర్లు | నిర్దిష్ట mRNA సీక్వెన్స్లను లక్ష్యంగా చేసుకునే అనుకూల ప్రైమర్లు | నిర్దిష్ట cDNA లైబ్రరీ
సున్నితత్వాన్ని మెరుగుపరచండి
రివర్స్ qPCR ప్రైమర్లను ఉపయోగించడం | ఒకే లక్ష్య జన్యువు యొక్క సంశ్లేషణకు మాత్రమే పరిమితం చేయబడింది |
రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్టేజ్
రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్టేజ్ అనేది DNAను సంశ్లేషణ చేయడానికి RNAను ఉపయోగించే ఎంజైమ్.కొన్ని రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్టేజ్లు RNase కార్యాచరణను కలిగి ఉంటాయి మరియు ట్రాన్స్క్రిప్షన్ తర్వాత RNA-DNA హైబ్రిడ్ స్ట్రాండ్లలో RNA స్ట్రాండ్లను క్షీణింపజేస్తాయి.దీనికి RNase ఎంజైమాటిక్ కార్యాచరణ లేకపోతే, అధిక qPCR సామర్థ్యం కోసం RNaseH జోడించబడుతుంది.సాధారణంగా ఉపయోగించే ఎంజైమ్లలో మోలోనీ మురిన్ లుకేమియా వైరస్ రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్టేజ్ మరియు ఏవియన్ మైలోబ్లాస్టోమా వైరస్ రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్టేజ్ ఉన్నాయి.RT-qPCR కోసం, అధిక థర్మోస్టాబిలిటీతో రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్టేజ్ను ఎంచుకోవడం ఉత్తమం, తద్వారా cDNA సంశ్లేషణను అధిక ఉష్ణోగ్రతల వద్ద నిర్వహించవచ్చు, అధిక సెకండరీ నిర్మాణంతో RNAల యొక్క విజయవంతమైన ట్రాన్స్క్రిప్షన్ను నిర్ధారిస్తుంది, అదే సమయంలో ప్రతిచర్య అంతటా వాటి పూర్తి కార్యాచరణను కొనసాగిస్తుంది, ఫలితంగా అధిక cDNA దిగుబడి వస్తుంది.
సంబంధిత ఉత్పత్తులు:
ముందస్తు M-MLV రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్టేజ్
రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్టేజ్ యొక్క RNase H కార్యాచరణ
RNaseH RNA-DNA డ్యూప్లెక్స్ల నుండి RNA తంతువులను అధోకరణం చేయగలదు, డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA యొక్క సమర్థవంతమైన సంశ్లేషణను అనుమతిస్తుంది.అయినప్పటికీ, పొడవైన mRNAని ఒక టెంప్లేట్గా ఉపయోగిస్తున్నప్పుడు, RNA ముందుగానే అధోకరణం చెందుతుంది, ఫలితంగా cDNA కత్తిరించబడుతుంది.అందువల్ల, పొడవైన ట్రాన్స్క్రిప్ట్ల సంశ్లేషణ కావాలనుకుంటే cDNA క్లోనింగ్ సమయంలో RNaseH కార్యాచరణను తగ్గించడం తరచుగా ప్రయోజనకరంగా ఉంటుంది.దీనికి విరుద్ధంగా, RNase H కార్యాచరణతో కూడిన రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్టేజ్లు తరచుగా qPCR అనువర్తనాలకు ప్రయోజనకరంగా ఉంటాయి ఎందుకంటే అవి PCR యొక్క మొదటి చక్రంలో RNA-DNA డ్యూప్లెక్స్ల ద్రవీభవనాన్ని మెరుగుపరుస్తాయి.
ప్రైమర్ డిజైన్
RT-qPCRలో qPCR దశ కోసం ఉపయోగించే PCR ప్రైమర్లు ఎక్సాన్-ఎక్సాన్ జంక్షన్ను విస్తరించేలా ఆదర్శంగా రూపొందించబడాలి, ఇక్కడ యాంప్లిఫికేషన్ ప్రైమర్ వాస్తవమైన ఎక్సాన్-ఇంట్రాన్ సరిహద్దును విస్తరించగలదు.ఇంట్రాన్-కలిగిన జన్యుసంబంధమైన DNA శ్రేణులు విస్తరించబడనందున, ఈ డిజైన్ జన్యుసంబంధమైన DNAని కలుషితం చేయడం నుండి విస్తరించిన తప్పుడు పాజిటివ్ల ప్రమాదాన్ని తగ్గిస్తుంది.
ఎక్సోన్లు లేదా ఎక్సాన్-ఎక్సాన్ సరిహద్దులను వేరు చేయడానికి ప్రైమర్లను రూపొందించలేకపోతే, జన్యుసంబంధమైన DNA కాలుష్యాన్ని తొలగించడానికి RNA నమూనాలను RNase-రహిత DNase I లేదా dsDNaseతో చికిత్స చేయడం అవసరం కావచ్చు.
RT-qPCR నియంత్రణ
DNA కాలుష్యాన్ని గుర్తించడానికి అన్ని RT-qPCR ప్రయోగాలలో రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ నెగటివ్ కంట్రోల్ (-RT కంట్రోల్) చేర్చబడాలి (మునుపటి ప్రతిచర్యల నుండి జెనోమిక్ DNA లేదా PCR ఉత్పత్తులు వంటివి).ఈ నియంత్రణ రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్టేజ్ మినహా అన్ని ప్రతిచర్య భాగాలను కలిగి ఉంటుంది.ఈ నియంత్రణతో రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ జరగదు కాబట్టి, PCR యాంప్లిఫికేషన్ గమనించినట్లయితే, DNA నుండి కలుషితం అయ్యే అవకాశం ఉంది.
పోస్ట్ సమయం: ఆగస్ట్-02-2022