PCR అనేది అత్యంత విస్తృతంగా ఉపయోగించే న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ యాంప్లిఫికేషన్ టెక్నాలజీ మరియు దాని సున్నితత్వం మరియు నిర్దిష్టత కారణంగా విస్తృతంగా ఉపయోగించబడుతుంది.అయినప్పటికీ, PCRకి పదేపదే థర్మల్ డీనాటరేషన్ అవసరమవుతుంది మరియు క్లినికల్ ఫీల్డ్ టెస్టింగ్‌లో దాని అప్లికేషన్‌ను పరిమితం చేసే సాధనాలు మరియు పరికరాలపై ఆధారపడే పరిమితులను వదిలించుకోలేము.

1990ల ప్రారంభం నుండి, అనేక ప్రయోగశాలలు థర్మల్ డీనాటరేషన్ అవసరం లేని స్థిరమైన ఉష్ణోగ్రత విస్తరణ సాంకేతికతను అభివృద్ధి చేయడం ప్రారంభించాయి.ఇప్పుడు వారు లూప్-మెడియేటెడ్ ఐసోథర్మల్ యాంప్లిఫికేషన్ టెక్నాలజీ, స్ట్రాండ్ రీప్లేస్‌మెంట్ ఐసోథర్మల్ యాంప్లిఫికేషన్ టెక్నాలజీ, రోలింగ్ సర్కిల్ ఐసోథర్మల్ యాంప్లిఫికేషన్ టెక్నాలజీ మరియు న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ సీక్వెన్స్ డిపెండెన్స్‌ని అభివృద్ధి చేశారు.ఐసోథర్మల్ యాంప్లిఫికేషన్ టెక్నాలజీ మరియు ఇతర సాంకేతికతలు. 

Loop-మెడియేటెడ్ ఐసోథర్మల్ యాంప్లిఫికేషన్

విస్తరణ సూత్రం DNA దాదాపు 65°C వద్ద డైనమిక్ సమతౌల్య స్థితిలో ఉందనే వాస్తవంపై ఆధారపడి ఉంటుంది.ఏదైనా ప్రైమర్ బేస్-పెయిర్డ్ మరియు డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA యొక్క కాంప్లిమెంటరీ భాగానికి విస్తరించినప్పుడు, ఇతర స్ట్రాండ్ విడదీయబడుతుంది మరియు సింగిల్ స్ట్రాండెడ్ అవుతుంది.

ఈ ఉష్ణోగ్రత వద్ద, స్ట్రాండ్-డిస్ప్లేస్‌మెంట్ DNA యొక్క సంశ్లేషణను నిరంతరంగా స్వీయ-ప్రసరణ చేయడానికి DNA పాలీమరేస్‌పై ఆధారపడేందుకు DNA 4 నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌లను ఉపయోగిస్తుంది.

ముందుగా లక్ష్య జన్యువుపై 6 నిర్దిష్ట ప్రాంతాల F3, F2, F1, B1, B2, B3ని నిర్ణయించండి, ఆపై ఈ 6 నిర్దిష్ట ప్రాంతాల ఆధారంగా 4 ప్రైమర్‌లను రూపొందించండి (క్రింద చిత్రంలో చూపిన విధంగా):

ఫార్వర్డ్ ఇన్నర్ ప్రైమర్ (FIP) F1c మరియు F2తో కూడి ఉంటుంది.

బ్యాక్‌వర్డ్ ఇన్నర్ ప్రైమర్ (BIP) B1c మరియు B2తో కూడి ఉంటుంది మరియు TTTT మధ్యలో స్పేసర్‌గా ఉపయోగించబడుతుంది.

బాహ్య ప్రైమర్‌లు F3 మరియు B3 వరుసగా లక్ష్య జన్యువుపై F3 మరియు B3 ప్రాంతాలతో కూడి ఉంటాయి.

LAMP ప్రతిచర్య వ్యవస్థలో, అంతర్గత ప్రైమర్ యొక్క ఏకాగ్రత బాహ్య ప్రైమర్ కంటే చాలా రెట్లు ఉంటుంది.DNA డబుల్ స్ట్రాండ్‌ను రూపొందించడానికి కాంప్లిమెంటరీ స్ట్రాండ్‌ను సంశ్లేషణ చేయడానికి లోపలి ప్రైమర్ మొదట టెంప్లేట్ స్ట్రాండ్‌తో కలిపి ఉంటుంది.తదనంతరం, DNA డబుల్ స్ట్రాండ్‌ను రూపొందించడానికి బాహ్య ప్రైమర్ టెంప్లేట్ స్ట్రాండ్‌తో కలిపి ఉంటుంది.BstDNA పాలిమరేస్ చర్యలో, అంతర్గత ప్రైమర్ ద్వారా సంశ్లేషణ చేయబడిన కాంప్లిమెంటరీ స్ట్రాండ్ విడుదల చేయబడుతుంది.వరుస ప్రతిచర్యల తర్వాత, కాంప్లిమెంటరీ స్ట్రాండ్ చివరకు డంబెల్ నిర్మాణంతో ఒకే DNA స్ట్రాండ్‌ను ఏర్పరుస్తుంది.

డంబెల్ స్ట్రక్చర్ DNA సింగిల్ స్ట్రాండ్ దానంతట అదే ఒక టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించబడుతుంది, ఇది నిరంతరంగా ఓపెన్ ఎండ్‌తో ట్రాన్సిషనల్ స్టెమ్-లూప్ స్ట్రక్చర్ DNAని రూపొందించడానికి.లోపలి మరియు బయటి ప్రైమర్‌లు ట్రాన్‌సిషనల్ స్టెమ్-లూప్ స్ట్రక్చర్ DNAను నిరంతరం స్ట్రాండ్ డిస్‌ప్లేస్‌మెంట్ మరియు ఎక్స్‌టెన్షన్ రియాక్షన్‌లకు గురిచేయడానికి మార్గనిర్దేశం చేస్తాయి మరియు చివరకు వివిధ పొడవులతో బహుళ స్టెమ్-లూప్ నిర్మాణాలను ఏర్పరుస్తాయి.DNA మిశ్రమం.

లూప్-మెడియేటెడ్ ఐసోథర్మల్ యాంప్లిఫికేషన్ యొక్క ప్రయోజనాలు మరియు అప్రయోజనాలు

LAMP యొక్క ప్రయోజనాలు:

(1) అధిక యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం, ​​ఇది లక్ష్య జన్యువు యొక్క 1-10 కాపీలను 1గంలోపు సమర్థవంతంగా విస్తరించగలదు మరియు యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం సాధారణ PCR కంటే 10-100 రెట్లు ఉంటుంది.

(2) ప్రతిచర్య సమయం తక్కువగా ఉంటుంది, నిర్దిష్టత బలంగా ఉంది మరియు ప్రత్యేక పరికరాలు అవసరం లేదు.

LAMP యొక్క లోపాలు:

(1) ప్రైమర్‌ల అవసరాలు ముఖ్యంగా ఎక్కువ.

(2) విస్తరించిన ఉత్పత్తి క్లోనింగ్ మరియు సీక్వెన్సింగ్ కోసం ఉపయోగించబడదు, కానీ తీర్పు కోసం మాత్రమే ఉపయోగించబడుతుంది.

(3) దాని బలమైన సున్నితత్వం కారణంగా, ఏరోసోల్‌లను రూపొందించడం సులభం, తప్పుడు పాజిటివ్‌లకు కారణమవుతుంది మరియు పరీక్ష ఫలితాలను ప్రభావితం చేస్తుంది.

Sట్రాండ్ డిస్ప్లేస్‌మెంట్ యాంప్లిఫికేషన్

స్ట్రాండ్ డిస్‌ప్లేస్‌మెంట్ యాంప్లిఫికేషన్ (SDA) అనేది 1992లో అమెరికన్ పండితుడు వాకర్ ప్రతిపాదించిన ఎంజైమాటిక్ రియాక్షన్‌పై ఆధారపడిన ఇన్ విట్రో ఐసోథర్మల్ DNA యాంప్లిఫికేషన్ టెక్నిక్.

SDA యొక్క ప్రాథమిక వ్యవస్థలో పరిమితి ఎండోన్యూక్లీస్, స్ట్రాండ్ డిస్‌ప్లేస్‌మెంట్ యాక్టివిటీతో కూడిన DNA పాలిమరేస్, రెండు జతల ప్రైమర్‌లు, dNTPలు మరియు కాల్షియం మరియు మెగ్నీషియం అయాన్‌లు మరియు బఫర్ సిస్టమ్‌లు ఉన్నాయి.

స్ట్రాండ్ డిస్‌ప్లేస్‌మెంట్ యాంప్లిఫికేషన్ సూత్రం లక్ష్యం DNA యొక్క రెండు చివర్లలో రసాయనికంగా సవరించిన పరిమితి ఎండోన్యూకలీస్ గుర్తింపు క్రమం మీద ఆధారపడి ఉంటుంది.ఎండోన్యూకలీస్ స్ట్రాండ్ DNAలోని గ్యాప్‌ను దాని గుర్తింపు సైట్‌లో తెరుస్తుంది మరియు DNA పాలిమరేస్ గ్యాప్ 3′ ఎండ్‌ను విస్తరిస్తుంది మరియు తదుపరి DNA స్ట్రాండ్‌ను భర్తీ చేస్తుంది.

DNA యొక్క భర్తీ చేయబడిన సింగిల్ స్ట్రాండ్‌లను ప్రైమర్‌లతో కలపవచ్చు మరియు DNA పాలిమరేస్ ద్వారా డబుల్ స్ట్రాండ్‌లుగా విస్తరించవచ్చు.ఈ ప్రక్రియ నిరంతరం పునరావృతమవుతుంది, తద్వారా లక్ష్య క్రమం సమర్థవంతంగా విస్తరించబడుతుంది.

స్ట్రాండ్ డిస్ప్లేస్‌మెంట్ యాంప్లిఫికేషన్ టెక్నాలజీ యొక్క ప్రయోజనాలు మరియు అప్రయోజనాలు

SDA యొక్క ప్రయోజనాలు:

యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం ఎక్కువగా ఉంటుంది, ప్రతిచర్య సమయం తక్కువగా ఉంటుంది, నిర్దిష్టత బలంగా ఉంది మరియు ప్రత్యేక పరికరాలు అవసరం లేదు.

SDA యొక్క లోపాలు:

ఉత్పత్తులు ఏకరీతిగా ఉండవు మరియు కొన్ని సింగిల్-స్ట్రాండ్ మరియు డబుల్ స్ట్రాండెడ్ ఉత్పత్తులు ఎల్లప్పుడూ SDA చక్రంలో ఉత్పత్తి చేయబడతాయి మరియు ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా గుర్తించబడినప్పుడు టైలింగ్ అనివార్యంగా సంభవిస్తుంది.

Rolling సర్కిల్ యాంప్లిఫికేషన్

రోలింగ్ సర్కిల్ యాంప్లిఫికేషన్ (RCA) రోలింగ్ సర్కిల్ ద్వారా వ్యాధికారక జీవుల నుండి DNA ను కాపీ చేసే పద్ధతిని గీయడం ద్వారా ప్రతిపాదించబడింది.ఇది స్థిరమైన ఉష్ణోగ్రత వద్ద ఒక టెంప్లేట్‌గా సింగిల్-స్ట్రాండ్ వృత్తాకార DNA యొక్క ఉపయోగాన్ని సూచిస్తుంది మరియు లక్ష్య జన్యువు యొక్క విస్తరణను సాధించడానికి రోలింగ్ సర్కిల్ DNA సంశ్లేషణ చర్యలో ఒక ప్రత్యేక DNA పాలిమరేస్ (Phi29 వంటివి) .

RCAని లీనియర్ యాంప్లిఫికేషన్ మరియు ఎక్స్‌పోనెన్షియల్ యాంప్లిఫికేషన్‌గా విభజించవచ్చు.లీనియర్ RCA యొక్క సామర్థ్యం 10కి చేరుకోవచ్చు⁵సార్లు, మరియు ఘాతాంక RCA సామర్థ్యం 10కి చేరుకోవచ్చు⁹సార్లు.

సాధారణ వ్యత్యాసం, దిగువ చిత్రంలో చూపిన విధంగా, లీనియర్ యాంప్లిఫికేషన్ 1 ప్రైమర్‌ను మాత్రమే ఉపయోగిస్తుంది, ఎక్స్‌పోనెన్షియల్ యాంప్లిఫికేషన్ b 2 ప్రైమర్‌లను కలిగి ఉంటుంది.

లీనియర్ RCAని సింగిల్ ప్రైమర్ RCA అని కూడా అంటారు.ప్రైమర్ వృత్తాకార DNAతో బంధిస్తుంది మరియు DNA పాలిమరేస్ చర్య ద్వారా విస్తరించబడుతుంది.ఉత్పత్తి అనేది ఒకే లూప్ పొడవు కంటే వేల రెట్లు పెద్ద సంఖ్యలో పునరావృత శ్రేణులతో కూడిన సరళ సింగిల్ స్ట్రాండ్.

లీనియర్ RCA యొక్క ఉత్పత్తి ఎల్లప్పుడూ ప్రారంభ ప్రైమర్‌కు అనుసంధానించబడి ఉంటుంది కాబట్టి, సిగ్నల్ యొక్క సులభమైన స్థిరీకరణ ఒక ప్రధాన ప్రయోజనం.

ఎక్స్‌పోనెన్షియల్ RCA, హైపర్ బ్రాంచ్డ్ యాంప్లిఫికేషన్ HRCA (హైపర్ బ్రాంచ్డ్ RCA) అని కూడా పిలుస్తారు, ఎక్స్‌పోనెన్షియల్ RCAలో, ఒక ప్రైమర్ RCA ఉత్పత్తిని పెంచుతుంది, రెండవ ప్రైమర్ RCA ప్రోడక్ట్‌తో హైబ్రిడైజ్ చేయబడుతుంది మరియు విస్తరించబడుతుంది మరియు భర్తీ ఇప్పటికే RCA ఉత్పత్తికి కట్టుబడి ఉంది.

రోలింగ్ సర్కిల్ న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ యాంప్లిఫికేషన్ యొక్క ప్రయోజనాలు మరియు అప్రయోజనాలు

RCA యొక్క ప్రయోజనాలు:

అధిక సున్నితత్వం, మంచి నిర్దిష్టత మరియు సులభమైన ఆపరేషన్.

RCA యొక్క లోపాలు:

సిగ్నల్ గుర్తింపు సమయంలో నేపథ్య సమస్యలు.RCA ప్రతిచర్య సమయంలో, సర్క్యులేట్ చేయని ప్యాడ్‌లాక్ ప్రోబ్ మరియు అన్‌బౌండ్ ప్రోబ్ యొక్క టెంప్లేట్ DNA లేదా RNA కొన్ని నేపథ్య సంకేతాలను రూపొందించవచ్చు. 

Nయూక్లికాసిడ్ సీక్వెన్స్-బేస్డ్ యాంప్లిఫికేషన్

న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ సీక్వెన్స్-బేస్డ్ యాంప్లిఫికేషన్ (NASBA) అనేది PCR ఆధారంగా అభివృద్ధి చేయబడిన కొత్త సాంకేతికత.ఇది T7 ప్రమోటర్ సీక్వెన్స్‌తో ఒక జత ప్రైమర్‌లచే మార్గనిర్దేశం చేయబడిన నిరంతర మరియు ఐసోథర్మల్ న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ యాంప్లిఫికేషన్.సాంకేతికత దాదాపు 2 గంటల్లో టెంప్లేట్ RNAని 109 రెట్లు విస్తరించగలదు, ఇది సంప్రదాయ PCR పద్ధతి కంటే 1000 రెట్లు ఎక్కువ మరియు ప్రత్యేక పరికరాలు అవసరం లేదు.

వ్యాధులు కనిపించిన వెంటనే త్వరితగతిన రోగ నిర్ధారణ చేయడానికి ఈ సాంకేతికత ఉపయోగించబడింది మరియు ప్రస్తుతం చాలా కంపెనీలు RNA డిటెక్షన్ కిట్‌లలో ఈ పద్ధతిని ఉపయోగిస్తున్నాయి.

RNA యాంప్లిఫికేషన్ రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ PCR సాంకేతికతను కూడా ఉపయోగించగలిగినప్పటికీ, NASBA దాని స్వంత ప్రయోజనాలను కలిగి ఉంది: ఇది సాపేక్షంగా స్థిరమైన ఉష్ణోగ్రత పరిస్థితులలో నిర్వహించబడుతుంది మరియు సాంప్రదాయ PCR సాంకేతికత కంటే ఇది మరింత స్థిరంగా మరియు ఖచ్చితమైనది.

ప్రతిచర్య 41 డిగ్రీల సెల్సియస్ వద్ద ఉంటుంది మరియు పూర్తి చేయడానికి AMV (ఏవియన్ మైలోబ్లాస్టోసిస్ వైరస్) రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టేజ్, RNase H, T7 RNA పాలిమరేస్ మరియు ఒక జత ప్రైమర్‌లు అవసరం.

ప్రక్రియ ప్రధానంగా వీటిని కలిగి ఉంటుంది:

ఫార్వర్డ్ ప్రైమర్ T7 ప్రమోటర్ యొక్క కాంప్లిమెంటరీ సీక్వెన్స్‌ని కలిగి ఉంది.ప్రతిచర్య సమయంలో, ఫార్వర్డ్ ప్రైమర్ RNA స్ట్రాండ్‌తో బంధిస్తుంది మరియు DNA-RNA డబుల్ స్ట్రాండ్‌ను రూపొందించడానికి AMV ఎంజైమ్ ద్వారా ఉత్ప్రేరకమవుతుంది.

RNase H హైబ్రిడ్ డబుల్-స్ట్రాండ్‌లోని RNAని జీర్ణం చేస్తుంది మరియు సింగిల్ స్ట్రాండెడ్ DNAని నిలుపుకుంటుంది.

రివర్స్ ప్రైమర్ మరియు AMV ఎంజైమ్ చర్యలో, T7 ప్రమోటర్ క్రమాన్ని కలిగి ఉన్న DNA డబుల్ స్ట్రాండ్ ఏర్పడుతుంది.

T7 RNA పాలిమరేస్ చర్యలో, ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ప్రక్రియ పూర్తయింది మరియు పెద్ద మొత్తంలో లక్ష్యం RNA ఉత్పత్తి చేయబడుతుంది.

NASBA యొక్క ప్రయోజనాలు:

(1) దీని ప్రైమర్‌లో T7 ప్రమోటర్ సీక్వెన్స్ ఉంది, కానీ విదేశీ డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNAకి T7 ప్రమోటర్ సీక్వెన్స్ లేదు మరియు విస్తరించబడదు, కాబట్టి ఈ సాంకేతికత అధిక నిర్దిష్టత మరియు సున్నితత్వాన్ని కలిగి ఉంటుంది.

(2) NASBA నేరుగా రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ప్రక్రియను యాంప్లిఫికేషన్ రియాక్షన్‌లో కలుపుతుంది, ప్రతిచర్య సమయాన్ని తగ్గిస్తుంది.

NASBA యొక్క ప్రతికూలతలు:

(1) ప్రతిచర్య భాగాలు మరింత క్లిష్టంగా ఉంటాయి.

(2) ప్రతిచర్య ఖర్చు ఎక్కువ కావడానికి మూడు రకాల ఎంజైమ్‌లు అవసరం.