ఫ్లోరోసెన్స్ క్వాంటిటేటివ్ PCR (దీనిని TaqMan PCR అని కూడా పిలుస్తారు, ఇకపై FQ-PCR అని కూడా పిలుస్తారు) అనేది 1995లో యునైటెడ్ స్టేట్స్‌లో PE (పెర్కిన్ ఎల్మెర్) చే అభివృద్ధి చేయబడిన ఒక కొత్త న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ క్వాంటిటేటివ్ టెక్నాలజీ. ఈ సాంకేతికత ఫ్లోరోసెంట్ లేబుల్ చేయబడిన ప్రోబ్‌లను జోడించడం ద్వారా సంప్రదాయ PCRపై ఆధారపడి ఉంటుంది.సౌకర్యవంతమైన PCRతో పోలిస్తే, FQ-PCR దాని పరిమాణాత్మక పనితీరును గ్రహించడానికి అనేక ప్రయోజనాలను కలిగి ఉంది.ఈ వ్యాసం సాంకేతికత యొక్క లక్షణాలు, సూత్రాలు, పద్ధతులు మరియు అనువర్తనాలను క్లుప్తంగా వివరించడానికి ఉద్దేశించబడింది.

1 ఫీచర్లు

FQ-PCR సాధారణ PCR యొక్క అధిక సున్నితత్వాన్ని కలిగి ఉండటమే కాకుండా, ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్స్ యొక్క అప్లికేషన్ కారణంగా, ఫోటోఎలెక్ట్రిక్ కండక్షన్ సిస్టమ్ ద్వారా PCR విస్తరణ సమయంలో ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్ యొక్క మార్పును నేరుగా గుర్తించగలదు, ఇది పరిమాణాత్మక ఫలితాలను పొందగలదు, ఇది సంప్రదాయ PCR యొక్క అనేక లోపాలను అధిగమిస్తుంది.

ఉదాహరణకు, సాధారణ PCR ఉత్పత్తులను అతినీలలోహిత కాంతితో అగరోజ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ మరియు ఎథిడియం బ్రోమైడ్ స్టెయినింగ్ లేదా పాలియాక్రిలమైడ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ మరియు సిల్వర్ స్టెయినింగ్ ద్వారా గమనించాలి.దీనికి బహుళ సాధనాలు అవసరం మాత్రమే కాకుండా, సమయం మరియు కృషి కూడా అవసరం.ఎథిడియం బ్రోమైడ్ ఉపయోగించిన మరకలు మానవ శరీరానికి హానికరం, మరియు ఈ సంక్లిష్టమైన ప్రయోగాత్మక విధానాలు కాలుష్యం మరియు తప్పుడు పాజిటివ్‌లకు అవకాశాలను అందిస్తాయి.అయినప్పటికీ, నమూనా లోడింగ్ సమయంలో FQ-PCR ఒక్కసారి మాత్రమే మూత తెరవవలసి ఉంటుంది మరియు తదుపరి ప్రక్రియ పూర్తిగా క్లోజ్డ్-ట్యూబ్ ఆపరేషన్, దీనికి PCR పోస్ట్-ప్రాసెసింగ్ అవసరం లేదు, సంప్రదాయ PCR ఆపరేషన్‌లలో అనేక లోపాలను నివారిస్తుంది.ప్రయోగం సాధారణంగా PE కంపెనీ అభివృద్ధి చేసిన ABI7100 PCR థర్మల్ సైక్లర్‌ను ఉపయోగిస్తుంది.

పరికరం క్రింది లక్షణాలను కలిగి ఉంది: ① విస్తృత అప్లికేషన్: ఇది DNA మరియు RNA PCR ఉత్పత్తి పరిమాణం, జన్యు వ్యక్తీకరణ పరిశోధన, వ్యాధికారక గుర్తింపు మరియు PCR పరిస్థితుల ఆప్టిమైజేషన్ కోసం ఉపయోగించవచ్చు.② ప్రత్యేక పరిమాణాత్మక సూత్రం: ఫ్లోరోసెంట్‌గా లేబుల్ చేయబడిన ప్రోబ్‌లను ఉపయోగించి, ఫ్లోరోసెన్స్ మొత్తం PCR సైకిల్‌తో లేజర్ ఉత్తేజితం తర్వాత పేరుకుపోతుంది, తద్వారా పరిమాణీకరణ యొక్క ప్రయోజనాన్ని సాధించవచ్చు.③ అధిక పని సామర్థ్యం: అంతర్నిర్మిత 9600 PCR థర్మల్ సైక్లర్, 96 నమూనాల విస్తరణ మరియు పరిమాణాన్ని స్వయంచాలకంగా మరియు ఏకకాలంలో పూర్తి చేయడానికి కంప్యూటర్ 1 నుండి 2 గంటల వరకు నియంత్రించబడుతుంది.④ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ అవసరం లేదు: నమూనాను పలుచన మరియు ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ చేయవలసిన అవసరం లేదు, రియాక్షన్ ట్యూబ్‌లో నేరుగా గుర్తించడానికి ప్రత్యేక ప్రోబ్‌ని ఉపయోగించండి.⑤పైప్‌లైన్‌లో కాలుష్యం లేదు: ప్రత్యేకమైన పూర్తిగా మూసివున్న రియాక్షన్ ట్యూబ్ మరియు ఫోటోఎలెక్ట్రిక్ కండక్షన్ సిస్టమ్ అవలంబించబడ్డాయి, కాబట్టి కాలుష్యం గురించి ఆందోళన చెందాల్సిన అవసరం లేదు.⑥ఫలితాలు పునరుత్పత్తి చేయబడతాయి: పరిమాణాత్మక డైనమిక్ పరిధి ఐదు ఆర్డర్‌ల మాగ్నిట్యూడ్ వరకు ఉంటుంది.అందువల్ల, ఈ సాంకేతికత విజయవంతంగా అభివృద్ధి చేయబడినప్పటి నుండి, ఇది చాలా మంది శాస్త్రీయ పరిశోధకులచే విలువైనది మరియు అనేక రంగాలలో వర్తించబడింది.

2 సూత్రాలు మరియు పద్ధతులు

PCR రియాక్షన్ సిస్టమ్‌కు ఫ్లోరోసెంట్‌గా లేబుల్ చేయబడిన ప్రోబ్‌ను జోడించడానికి టాక్ ఎంజైమ్ యొక్క 5′→3′ ఎక్సోన్యూకలీస్ యాక్టివిటీని ఉపయోగించడం FQ-PCR యొక్క పని సూత్రం.ప్రైమర్ సీక్వెన్స్‌లో ఉన్న DNA టెంప్లేట్‌తో ప్రోబ్ ప్రత్యేకంగా హైబ్రిడైజ్ చేయగలదు.ప్రోబ్ యొక్క 5′ఎండ్ ఫ్లోరోసెన్స్ ఎమిషన్ జీన్ FAM (6-కార్బాక్సీఫ్లోరోసెసిన్, ఫ్లోరోసెన్స్ ఎమిషన్ పీక్ 518nm)తో లేబుల్ చేయబడింది మరియు 3′ఎండ్ ఫ్లోరోసెన్స్ క్వెన్చింగ్ గ్రూప్ TAMRA (6-కార్బాక్సిటెట్‌మీథైల్‌థైల్‌థైల్ 3)తో లేబుల్ చేయబడింది. PCR యాంప్లిఫికేషన్ సమయంలో ప్రోబ్ పొడిగించబడకుండా నిరోధించడానికి ప్రోబ్ యొక్క ప్రారంభం ఫాస్ఫోరైలేట్ చేయబడింది.ప్రోబ్ చెక్కుచెదరకుండా ఉన్నప్పుడు, క్వెన్చర్ సమూహం ఉద్గార సమూహం యొక్క ఫ్లోరోసెన్స్ ఉద్గారాలను అణిచివేస్తుంది.ఉద్గార సమూహాన్ని క్వెన్చింగ్ గ్రూప్ నుండి వేరు చేసిన తర్వాత, నిరోధం ఎత్తివేయబడుతుంది మరియు 518nm వద్ద ఆప్టికల్ సాంద్రత పెరుగుతుంది మరియు ఫ్లోరోసెన్స్ డిటెక్షన్ సిస్టమ్ ద్వారా కనుగొనబడుతుంది. పునరుద్ధరణ దశలో, ప్రోబ్ టెంప్లేట్ DNAతో హైబ్రిడైజ్ అవుతుంది మరియు పొడిగింపు దశలో DNA యొక్క Taq ఎంజైమ్ ప్రైమ్ టెంప్లేట్‌తో కదులుతుంది.ప్రోబ్ కత్తిరించబడినప్పుడు, చల్లార్చే ప్రభావం విడుదల చేయబడుతుంది మరియు ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్ విడుదల అవుతుంది.టెంప్లేట్ కాపీ చేయబడిన ప్రతిసారీ, ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్ విడుదలతో పాటు ప్రోబ్ కత్తిరించబడుతుంది.విడుదలైన ఫ్లోరోఫోర్‌ల సంఖ్య మరియు PCR ఉత్పత్తుల సంఖ్య మధ్య ఒకదానికొకటి సంబంధం ఉన్నందున, టెంప్లేట్‌ను ఖచ్చితంగా లెక్కించడానికి ఈ సాంకేతికతను ఉపయోగించవచ్చు.ప్రయోగాత్మక పరికరం సాధారణంగా PE కంపెనీ అభివృద్ధి చేసిన ABI7100 PCR థర్మల్ సైక్లర్‌ను ఉపయోగిస్తుంది మరియు ఇతర థర్మల్ సైక్లర్‌లను కూడా ఉపయోగించవచ్చు.ABI7700 రియాక్షన్ టైప్ రియాక్షన్ సిస్టమ్‌ను ప్రయోగం కోసం ఉపయోగించినట్లయితే, ప్రతిచర్య పూర్తయిన తర్వాత, కంప్యూటర్ విశ్లేషణ ద్వారా పరిమాణాత్మక ఫలితాలను నేరుగా ఇవ్వవచ్చు.మీరు ఇతర థర్మల్ సైక్లర్‌లను ఉపయోగిస్తుంటే, RQ+, RQ-, △RQలను లెక్కించడానికి అదే సమయంలో రియాక్షన్ ట్యూబ్‌లోని ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్‌ను కొలవడానికి మీరు ఫ్లోరోసెన్స్ డిటెక్టర్‌ను ఉపయోగించాలి.RQ+ అనేది నమూనా ట్యూబ్ యొక్క ఫ్లోరోసెంట్ ఉద్గార సమూహం యొక్క కాంతి తీవ్రత మరియు క్వెన్చింగ్ సమూహం యొక్క కాంతి తీవ్రత యొక్క నిష్పత్తిని సూచిస్తుంది, RQ- ఖాళీ ట్యూబ్‌లోని రెండింటి నిష్పత్తిని సూచిస్తుంది, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) అనేది PC యొక్క డేటా మార్పు తర్వాత ఫ్లోర్‌స్సీ మార్పుల సమయంలో డేటాను సూచిస్తుంది.ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్స్ పరిచయం కారణంగా, ప్రయోగం యొక్క విశిష్టత గణనీయంగా మెరుగుపడింది.ప్రోబ్ డిజైన్ సాధారణంగా కింది షరతులకు అనుగుణంగా ఉండాలి: ① బైండింగ్ యొక్క నిర్దిష్టతను నిర్ధారించడానికి ప్రోబ్ యొక్క పొడవు సుమారు 20-40 బేస్‌లు ఉండాలి.②సింగిల్ న్యూక్లియోటైడ్ సీక్వెన్స్‌ల డూప్లికేషన్‌ను నివారించడానికి GC బేస్‌ల కంటెంట్ 40% మరియు 60% మధ్య ఉంటుంది.③ హైబ్రిడైజేషన్ లేదా ప్రైమర్‌లతో అతివ్యాప్తిని నివారించండి.④ ప్రోబ్ మరియు టెంప్లేట్ మధ్య బైండింగ్ యొక్క స్థిరత్వం ప్రైమర్ మరియు టెంప్లేట్ మధ్య బైండింగ్ యొక్క స్థిరత్వం కంటే ఎక్కువగా ఉంటుంది, కాబట్టి ప్రోబ్ యొక్క Tm విలువ ప్రైమర్ యొక్క Tm విలువ కంటే కనీసం 5°C ఎక్కువగా ఉండాలి.అదనంగా, ప్రోబ్ యొక్క ఏకాగ్రత, ప్రోబ్ మరియు టెంప్లేట్ సీక్వెన్స్ మధ్య హోమోలజీ మరియు ప్రోబ్ మరియు ప్రైమర్ మధ్య దూరం అన్నీ ప్రయోగాత్మక ఫలితాలపై ప్రభావం చూపుతాయి.

సంబంధిత ఉత్పత్తులు:

చైనా Lnc-RT Heroᵀᴹ I(gDNaseతో)(lncRNA నుండి మొదటి-స్ట్రాండ్ cDNA సంశ్లేషణ కోసం సూపర్ ప్రీమిక్స్) తయారీదారు మరియు సరఫరాదారు |ఫోర్జీన్ (foreivd.com)

చైనా రియల్ టైమ్ PCR Easyᴹ-Taqman తయారీదారు మరియు సరఫరాదారు |ఫోర్జీన్ (foreivd.com)