PCR రియాజెంట్ల ప్రారంభ దశలో ప్రైమర్లు మరియు ప్రోబ్ల పనితీరును ధృవీకరించడం మరియు అత్యంత అనుకూలమైన ప్రతిచర్య పరిస్థితులను నిర్ణయించడం అనేది అధికారిక ప్రయోగాల సాఫీగా పురోగతిని నిర్ధారించడానికి ముందస్తు అవసరం.
కాబట్టి మేము ప్రారంభ దశలో ప్రైమర్ ప్రోబ్ను ఎలా నిర్ధారించాలి?
ప్రధాన సూచికలు బేస్లైన్, యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్, ct విలువ, యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం, తక్కువ-ఏకాగ్రత నమూనా గుర్తింపు, CV మొదలైనవి.
బేస్లైన్
బేస్లైన్ అనేది PCR యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్లోని క్షితిజ సమాంతర రేఖ.PCR యాంప్లిఫికేషన్ ప్రతిచర్య యొక్క మొదటి కొన్ని చక్రాలలో, ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్ పెద్దగా మారదు మరియు సరళ రేఖను ఏర్పరుస్తుంది.ఈ సరళ రేఖ ఆధారం.
PCR ప్రైమర్ ప్రోబ్స్ని స్క్రీనింగ్ చేస్తున్నప్పుడు, బేస్లైన్ లెవెల్గా ఉందో లేదో గమనించండి.ప్రైమర్ ప్రోబ్ ఏకాగ్రత యొక్క స్వచ్ఛత బేస్లైన్ను ప్రభావితం చేస్తుంది, బేస్లైన్ పెరగడం లేదా పడిపోవడం వంటివి.బేస్లైన్ కూడా చాలా సహజమైన సూచిక.
యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్
మరొక సహజమైన సూచిక యాంప్లిఫికేషన్ కర్వ్ యొక్క ఆకారం.సెకండరీ యాంప్లిఫికేషన్ లేదా ఇతర అసాధారణ యాంప్లిఫికేషన్ వక్రతలను నివారించడానికి S- ఆకారపు వక్రరేఖను కలిగి ఉండటం ఉత్తమం.
Ct విలువ
బేస్లైన్ నుండి ఎక్స్పోనెన్షియల్ గ్రోత్ వరకు ఇన్ఫ్లెక్షన్ పాయింట్కి సంబంధించిన చక్రాల సంఖ్య Ct విలువ.
ఒకే నమూనా కోసం, వేర్వేరు ప్రైమర్ ప్రోబ్లు వేర్వేరు యాంప్లిఫికేషన్ వక్రతలకు దారితీస్తాయి మరియు సంబంధిత Ct విలువ యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం మరియు జోక్యం డిగ్రీ ద్వారా ప్రభావితమవుతుంది.సిద్ధాంతంలో, మనం ఎంచుకున్న ప్రైమర్ ప్రోబ్ యొక్క Ct విలువ ఎంత చిన్నదైతే అంత మంచిది.
యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం
PCR యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని అంచనా వేయడానికి అత్యంత విశ్వసనీయమైన మరియు స్థిరమైన పద్ధతుల్లో ఒకటి ప్రామాణిక వక్రత, ఇది పరిశోధకులచే విస్తృతంగా గుర్తించబడింది.లక్ష్య టెంప్లేట్ల సాపేక్ష సంఖ్యను నియంత్రించడానికి నమూనాల శ్రేణిని తయారు చేయడం ఈ పద్ధతిలో ఉంటుంది.ఈ నమూనాలు సాధారణంగా సాంద్రీకృత స్టాక్ సొల్యూషన్ల సీరియల్ డైల్యూషన్ల ద్వారా తయారు చేయబడతాయి, సాధారణంగా ఉపయోగించేది 10 రెట్లు పలుచన.పలుచన చేసిన నమూనాల శ్రేణిని ఉపయోగించడం, Cq విలువను పొందేందుకు ప్రామాణిక qPCR ప్రోగ్రామ్ని ఉపయోగించడం, మరియు చివరగా ప్రతి నమూనా యొక్క ఏకాగ్రత మరియు Cq= -klgX0+b మరియు యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం E=10(-1 /k)-1 అనే సరళ సమీకరణాన్ని పొందేందుకు సంబంధిత Cq విలువ ప్రకారం ప్రామాణిక వక్రతను గీయండి.పరిమాణాత్మక విశ్లేషణ కోసం qPCRని ఉపయోగిస్తున్నప్పుడు, యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యం 90%-110% (3.6>k>3.1) పరిధిలో ఉండాలి.
తక్కువ సాంద్రత కలిగిన నమూనాల గుర్తింపు
నమూనా ఏకాగ్రత తక్కువగా ఉన్నప్పుడు, వివిధ ప్రైమర్ ప్రోబ్ల గుర్తింపు రేట్లు భిన్నంగా ఉంటాయి.మేము ప్రతిరూపం చేయడానికి 20 తక్కువ-ఏకాగ్రత నమూనాలను ఎంచుకుంటాము మరియు అత్యధిక గుర్తింపు రేటుతో ప్రైమర్-ప్రోబ్ సిస్టమ్ ఉత్తమమైనది.
కోఎఫీషియంట్ ఆఫ్ వేరియేషన్ (CV)
న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ యాంప్లిఫికేషన్ డిటెక్షన్ కోసం రియాజెంట్ యొక్క లైన్ స్టాండర్డ్ ప్రకారం వివిధ ప్రైమర్ ప్రోబ్స్తో 10 డూప్లికేట్ నమూనాలను గుర్తించవచ్చు.
పరిమాణాత్మక కారకాలు:
ఖచ్చితత్వం
ఒక బ్యాచ్లోని ఖచ్చితత్వానికి అనుగుణంగా ఉండాలి: పరీక్ష ఏకాగ్రత యొక్క లాగరిథమిక్ విలువ యొక్క వైవిధ్యం యొక్క గుణకం (CV,%) ≤5%.నమూనా ఏకాగ్రత తక్కువగా ఉన్నప్పుడు, గుర్తించే ఏకాగ్రత యొక్క లాగరిథమ్ యొక్క వైవిధ్యం యొక్క గుణకం (CV,%) ≤10%
గుణాత్మక కారకాలు:
ఖచ్చితత్వం
ఒక బ్యాచ్లోని ఖచ్చితత్వం తప్పనిసరిగా కలుసుకోవాలి:
(1) Ct విలువ (CV,%) ≤5% వైవిధ్యం యొక్క గుణకం
అదే నమూనా 10 సార్లు సమాంతరంగా పరీక్షించబడుతుంది మరియు పరీక్ష ఫలితాలు స్థిరంగా ఉండాలి
పోస్ట్ సమయం: సెప్టెంబర్-18-2021